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酶的提取与制备 酶是一类由生物细胞合成的具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。生物细胞均产生自己所需要的酶。生物体内的各种代谢反应，均需特殊的酶参加催化。存在于细胞内的酶称胞内酶。由细胞内合成而分泌到细胞外起作用的酶称胞外酶，如消化液及其它体液中的酶类。在酶作用下进行化学变化的物质称底物。酶催化的化学反应称酶促反应。 各种动物器官和体液含有酶的种类和数量差别甚大。一般所含酶的总量并不很少，但每一种酶的含量却很少，常用百万分之一至百分之几，如胰腺中含有5.0%的胰蛋白酶，而脱氧核糖核酸酶仅含0.004%(按干重计算)。在高等动物中，具有特殊功能的酶常只存在于某些专门器官细胞，如胃蛋白酶只存在于胃底粘膜腺的主细胞，脂肪酶存在于上皮细胞等。 酶催化活性的高效和专一性是其他催化剂所无法比拟的。一切生命现象几乎均在酶的参与下进行，各种代谢异常性疾病无不与酶失调有关。有些先天性障碍就是由于溶酶体中某些酶的缺乏所致。 中国早有对富酶成分鸡内金、五谷虫等入药的记载。近20年来酶与临床医学的关系愈来愈密切。这不仅是因为可以用酶作工具来诊断许多疾病，探索发病的机理，还因为不少酶类本身就是治疗疾病的药物。目前酶的应用已发展成为一门独立的学科——临床酶学。
酶类的提取与制备 UK在体内可活化血纤溶酶原成为血纤溶酶。它不仅活化血浆纤溶酶原而对血管壁的血纤酶原也有作用。对血纤溶蛋白、血纤溶蛋白原、凝血因子Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ等均有溶解作用，从而达到溶血栓、抗凝血作用。所以是一种十分有效的溶血栓剂。UK与肝素等抗凝剂不同，后者可防止血栓形成，但不溶解已形成的血栓。UK适用于严重的肺部栓塞。最大优点是无抗原性。 临床上UK已广泛用于治疗各种新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。如缺血性中风（脑血栓）、中央视网膜血管闭塞症、急性心肌梗塞、肺栓塞、四肢及周围动脉血栓症，以及人工肾、肾移植、动静脉交支血栓的形成、风湿性关节炎等。与抗癌药合用有良好协同作用。对外伤性前房出血效果也较好。毒副作用小，可多次较长时间使用。 激肽释放酶（Kallikrein,Kininogenase,Kininogenin,K） 属丝氨酸蛋白酶，包括于EC3.4.21.8中。早在1926年Frey曾发现尿中含有引起血压下降的物质。后来发现它也存在于唾液、血浆及胰脏中，尤其后者含量为最高，1930年被命名为Kallikrein. 它是一种蛋白水解酶，对酪蛋白及血红蛋白等一般蛋白几乎不水解，只作用于专一底物激肽原(Kininogen)引起限定分解。它也是迅速游离激肽(Kallidin)的专一性高的酶。广泛分布于血浆、胰、肾、颌下腺、肠、胰液及尿中。来源不同的激肽释放酶，其物理的和酶化学的性质不同。药用激肽释放酶主要来自颌下腺或胰腺。 常用鲜胰脏、胰酶、脱脂胰粉、颌下腺及男人尿等为原料制备K。K的提取分离法有有机溶剂分级沉淀法[73]、吸附法、离子交换法[74]、DEAE纤维素分离法[75，76]、凝胶过滤法[77]、硫酸铵结晶法[78，79]、制备电泳法[80]及亲合层析法等[81]。早在1962年已用电泳法从猪胰中分出KA及KB[80]。 一般猪胰粉或其他原料用水提取后，宜联用丙酮分级、DEAE-纤维素（Sephadex）层析，Sephadex凝胶过滤及羟基磷灰石柱层析等。 以猪颌下腺为原料，可经酸水提、氢氧化铝凝胶吸附分离及乙醇分级沉淀等操作制取K[69]。也可从生产弹性酶的废液，经离子交换树脂分离及有机溶剂分级沉淀等制取K。 弹性（蛋白）酶(Elastase,Pancreatopeptidase E,EC3.4.21.11) 是一种肽链内切酶，也属一种丝氨酸蛋白酶。早在1890年Wald就发现胰提取液具有溶解结缔组织弹性蛋白的功能。1949年Balo等发现胰脏提取物中含有一种能溶解主动脉壁上弹性纤维蛋白的新酶，命名为弹力纤维溶解酶（Elastolytic enzyme）或弹性（蛋白水解）酶。Davis首先从猪胰中分出弹性蛋白酶。1952年Banga得到牛胰弹性蛋白酶结晶之后，Hall从弹性酶中分出Elastomucase（E1）和Elastropoteinase(E2)两种成分。E1具有水解弹性粘蛋白活性，E2具有水解弹性蛋白的活性[89]。Naragunan等（1969）用层析法制得电泳均一的弹性酶[90]。Shotton(1970)报告了它的一级结构。 弹性酶广泛存在于哺乳动物及人的各种组织（胰、脾、肺、主动脉管及皮肤等）和体液（血液、血小板）中。在白细胞及巨噬细胞中也有发现。某些微生物如绿脓杆菌等也产生弹性酶。 胰弹性酶由胰腺细胞分泌，进入十二指肠，经胰蛋白酶或肠激酶，或自身激活后由酶原转为活性。人胰含弹性酶0.3～6.2U/g，牛胰含量约为人胰的5倍，猪胰蛋白酶制剂（Trypsin-300）含弹性酶为360U/g，大鼠胰弹性酶含量较高，猫、鸡、狗的胰液中也检验出弹性酶，人、猪、豚鼠的弹性酶具有不同的免疫特性。铵康（Lophius piscatorius）也含弹性酶。 活性及应用 影响脂质代谢、降低胆固醇、抑制动脉硬化发展 巴罗.巴克夫妇最初观察到动脉硬化患者胰脏分泌弹性酶减少。弹性酶的存在使动脉脉壁具有一定的弹性。血管壁中含有丰富的弹性蛋白，它来源于弹性蛋白原。弹性蛋白原分子量约76000，富含赖氨酸，还含有很大一部分非极性氨基酸，其结构中常借分子间隙赖氨酸正电荷与带负电荷的细胞间隙微原纤维糖蛋白相结合。在正常情况下，未伸长的肽键呈卷曲结构，把水分排于外部，并由疏水基因相互制约而保持稳定。在伸长情况下，疏水基的相互制约作用减弱，水分子即有机会和分子内的疏水结构部分相接触。脂类物质与弹性蛋白的疏水区相互作用，并由于疏水基的相互穿插，使结构松弛。因此由于脂质饱和而膨胀的弹性蛋白在弹性酶的作用下，势必很易水解成可溶性的肽段。 血管硬化时弹性蛋白所构成的弹性纤维断裂，断裂空隙中堆积胆固醇等脂质。为阐明原理用胆甾醇、胆酸、猪油等喂养大鼠造成动物病理模型，与给予弹性酶实验组比较，证明弹性酶对动脉硬化有预防作和保护作用，并使已硬化的血管“返轻化”。弹性酶还利于新弹性蛋白合成。实验表明，动脉硬化患者胰内弹性酶活力较健康青年低。老小鼠胰内弹性酶活力也较幼小鼠有明显的降低。而胆甾醇或弹性蛋白酶抑制剂则直接影响体内弹性酶的产生和激活，以致破坏体内酶的动态平衡，注入弹性酶可以使平衡获得恢复。 Dovid曾用公鸡实验发现，弹性酶能降低血中胆甾醇及游离脂酸量。给已动脉硬化的家兔及时口服弹性酶，可延缓动脉粥样斑块形成。大鼠实验证明，对正常动脉弹性纤维的走向和排列完全无影响，但在发生动脉硬化的大鼠则选择性地作用于病变部位的动脉，能抑制和除去动脉壁变性弹性蛋白上的脂肪和钙的沉积。 弹性蛋白酶能促进弹性纤维的新生，保持动脉壁正常。经电子显微镜观察和生化检验证实，能生理性地除去动脉壁的变性弹性蛋白。经大鼠、鸡胚和小鸡实验表明，弹性蛋白酶还具有促进大动脉平滑肌的纤维新生，促进动脉壁酸性粘多糖的产生和增强动脉壁的基质代谢等作用。 此外，弹性酶还可改善血清和组织中的异常代谢，促进肝中胆固醇的异化和排泄，提高脂蛋白酶的活性，使脂肪和脂蛋白代谢尤其对极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）的代谢有所改善，同时使血清、肝大动脉和脂肪组织异常脂酸组成正常化。体外实验证实，弹性蛋白酶明显的β-脂蛋白酶作用，分解乳糜微粒，切断酸性粘多糖和脂蛋白的结合，故可降血脂。同时还有促进胆甾醇异生为胆酸和加速胆汁排泄作用。有人认为弹性酶可降低血中胆甾醇、甘油三酯及磷脂，增加亚油酸，对动脉粥样硬化有阻止作用。 抑制实验性肝纤维化、脂肪肝增强肝中脂肪分解作用 有人发现弹性酶能活化磷酯酶A，增加脂蛋白脂肪酶，有显著抗脂肪肝作用。弹性酶对变性胶原蛋白的水解速率比对弹性蛋白水解速率高10倍。因此在四氯化碳诱发肝损害中弹性酶可抑制由此引起的肝纤维化。病人血液中常有弹性酶抑制剂。口服弹性酶抑制血中抑制剂的活力，参与重建血液中弹性酶--抑制剂系统的平衡。 弹性酶对由四氯化碳引起的慢性肝障碍的大鼠，可使肝纤维化得到抑制，使脂肪肝的脂质总量下降，脂肪肝的发生得到抑制。服弹性酶后动物肝细胞中的糖元显著增加，从而有保肝作用。 具有降血压耐缺氧保护心肌作用 实验表明，弹性酶能使减压缺氧的小白鼠的存活时间延长，降低异丙肾上腺素使小鼠缺氧的死亡率。对实验性大鼠的急性心肌缺血也有保护作用。对麻醉猫有明显降血压作用。对大鼠下肢血管有扩张作用。具有显著增加心肌营养性血流和扩张心肌血管作用。可使犬冠状动脉血流量增加，血中cAMP含量增高，利于解聚血小板凝集等。此外，还可扩张周围血管和毛细血管，其降压作用不受抗组胺药物影响。 其他作用 弹性酶可抑制大白鼠和小白鼠自发性糖尿病。增加蛙的平滑肌紧张。对动情期小白鼠增加子宫收缩。 白细胞及巨噬细胞的弹性酶样酶参与血中异物处理，尤其通过血浆α1-胰蛋白酶抑制剂调节其活性，该抑制剂缺乏时易患肺气肿。原因是由于血中弹性酶异常增大破坏肺泡所致。 又据实验表明，由于弹性组织的蛋白水解作用，游离促弹性组织分解活力可引起动脉炎、肺气肿等病理状态。有关它的生化、酶与抑制剂的相互作用以及在上述病理状态中酶在病因学中的作用研究，均需对其活力进行灵敏而精确的分析。 曾用碘标记的弹性酶进行口服后吸收、分布及排泄实验。发现肠道吸收酶在1%以下，给药6h后兔血浓度达高峰。吸收后与血清蛋白结合分布于各脏器，主要在肝中代谢。 毒性实验 急性毒性 小鼠ipLD50101.6mg/kg.小鼠灌胃及十二指肠给药均未见任何毒性反应。 亚急性毒性 对实验犬的体重、体温、血像、肝功、肾功、心电图等均无不良影响，组织学和病理学检查也未见任何毒性反应。 应用 弹性酶主要用于防治动脉硬化症、高脂血症（高胆甾醇、高甘油三酯）、高血压、糖尿病、脂肪肝等。也试用于外部溃疡（烫伤、皮肤溃疡、口腔溃疡）、慢性支气管炎及肺气肿等。 不良反应 罕见瘙痒感、有时腹泻、便秘、胃功能障碍，食欲不振及腹部胀感等。 蛇毒类凝血酶（Snak venoms thrombin-like enzyme） 1963年Reid首次发表了马来亚红口蝮蛇（Agkistrodom rhodostoma）咬伤研究的报告，数十例病人共同的特点凝血失调，丧失了凝结能力，原因是蛇毒里含有一种与人凝血酶（Thrombin）相似的酶，称类凝血酶（Thrombin-like，又译作凝血酶样），在人体内引起消耗性脱血纤蛋白降解形成松散的凝块，在体内这种凝块很易被纤溶酶（Plasmin）溶解，在酶的不断作用下消耗了血纤蛋白原，使血液呈低凝状态。由于对血液中凝血因子V.X.XII均无作用，不能像人凝血酶激活XII因子，使血纤蛋白形成交联的凝块，不易清除。因它不凝集血小板，故仍能维持正常止血功能，因而在临床上被用做防治血栓性疾病的有效抗凝药（商品名为抗栓酶、清栓酶、去纤酶等）。 与α-凝血酶不同，形成纤维蛋白凝血块时，仅释放纤维蛋白肽A。因此所生成的凝血块较α-凝血酶所产生的弱。一般认为是内部和内部所形成的纤维蛋白聚合物。不被除肝素外血中蛋白酶抑制剂的抗凝血酶Ⅲ所抑制，与α-凝血酶不同。 由于蛇毒类凝血酶对纤维蛋白原的作用方式不同于血浆凝血酶，它也被用作研究纤维蛋白凝聚机制的重要工具。 自Esnouf等人首先由红口蝮（Agkistrodom rhodostoma）毒液分离纯化得到具有凝血酶样活性组分以后，陆续从蝮蛇属（Agkistrodon）、响尾蛇属（Crotalus）、矛头蝮蛇属（Bothrops）蝰属、竹叶青属（Trimeresurus）中均分离得到凝血酶样活性组分。我国已从东北产蝮蛇、浙江产蝮蛇、尖吻蝮蛇及竹叶青等蛇毒中分出类凝血酶，并用于临床。最近几年里用于治疗静脉血栓、脑血栓等血管栓塞性疾病已有上万病例，疗效较好。 红口蝮蛇毒类凝血酶 Ancord(Arvin,EC3.4.21.28)是从红口蝮蛇毒中提出的类凝血酶，属于一种糖蛋白。有单体和二聚体。分子量35400。等电点pH4.2-6.2E1%280nm9.85.糖含量36.03%。最适pH8.5。合成抑制剂有DFP PMSF TLCK等。有显著的精氨酸酯酶活性，对纤维蛋白原的凝固作用不被肝素、水蛭素和大豆胰蛋白酶抑制剂所抑制。Acord作用于纤维蛋白原后，从中释放出3个纤维蛋白肽，即A、AP和AY，这与凝血酶的作用很相似，但不同的是Ancord不能释放B肽，即不能作用于纤维蛋白原的B链。 因Ancord是有限的切割纤维蛋白原，且不能活化因子XII，故作用于纤维蛋白原后所产生的是不能交联的，易于溶解的纤维蛋白块，这种纤维蛋白块能很快从循环中消失，从而引起血浆中的去纤作用。加之Ancord对其他凝血因子无影响，因此已作为一种抗凝血药物用于临床。 蝮蛇蛇毒类凝血酶 浙江产蝮蛇蛇毒含3种具有精氨酸酯酶活性的组分。它们是激肽释放酶、类凝血酶、类溶血纤溶酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高，约占总酯酶活力的60%。 该类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳呈一条区带。经凝胶过滤及SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳测定，分子量为43000，氨基酸组成分析表明，有较多酸性氨基酸及脯氨酸，含6%中性糖，9%已糖及3.3%唾液酸。 它可直接使血纤维蛋白原凝集，水解BAEE的活力约是胰蛋白酶的2.7倍，Km为3.4×10-4mol/L，高于其它已知蝮亚科蛇毒类类凝血酶活力。它不作用于BANA BAPA及其他蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样，对专一荧光底物Boc-Val-Arg-MCA有明显活性，但其凝结血纤维蛋白原的活性远低于人凝血酶。 此类凝血酶被DFP及MP所制，但抑制速度较慢，不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制，因而也是专一性较强的丝氨酸蛋白酶。 尖吻蝮蛇毒类凝血酶 从台湾尖吻蝮蛇毒中分出的一种类凝血酶，为酸性糖蛋白，分子量33500，不能活化XIII因子，组成中的Cys、His、Ser与酶活性有重要关系，因此活性可被苯基汞已酸和对氯汞苯甲酸所抑制。不同来源的纤维蛋白原对此酶的敏感性不同，来源于人的大于牛，牛的大于兔。 皖南产尖吻蝮蛇毒类凝血酶含11个Cys残基，经DTNB法得知天然状态类凝血酶有1个游离巯基，类凝血酶含有5对二硫键。皖南产尖吻蝮蛇毒类凝血酶长时间作用于纤维蛋白原仅降解α键，此同于Ancrod、Batroxibin及台湾尖吻蝮蛇，而不同于浙江产蝮蛇及响尾蛇（Crotalus）后者只降解β键。这种键专一性的差别表现了种属的差异性。 竹叶青（Trimeresurus Stejengeri）蛇毒类凝血酶 从江西产竹叶青蛇毒分出3种类凝血酶，组分I的分子量为54500，由261个氨基酸残基组成，其中Asp和Glu含量较高，含14%中性已糖，13.4%已糖胺和14.7%唾液酸，等电点3.5,在280nm的吸收系数E0.1%1cm0.855。组分II分出分子量分别为54000及470002个酶，被过碘酸-Schiff试剂染色，均是糖蛋白。组分I及II能凝固纤维蛋白原和水解凝血酶专一性三肽底物，具有精氨酸酯酶活性。平板法表明，组分I只有激活纤溶作用（激活胞浆素原），与尿激酶作用相似，而组分I与II既有激活纤溶又有直接纤溶作用。组分II能缓慢地降解人纤维蛋白原的α链，而随着时间的延长组分I还能进一步地部分降解人纤维蛋白原的β链。组分I能被丝氨酸蛋白酶的专一性抑制剂所抑制，是丝氨酸蛋白酶，其活性中心是丝氨酸残基。过碘酸能强烈抑制组分I的酶活性。因此组分I糖基部分对酶活性极重要。Zn2+、Cu2+、Fe3+对组分I和组分II的精氨酸酯酶活性有明显的抑制作用，Co2+对组分II的精氨酸酯酶活性有明显抑制作用。竹叶青类凝血酶与棕点竹叶青（T.gramincus）、黄绿络铁头（T.flavovirdis）类凝血酶有许多相似性。 矛头蝮蛇（Bothrops atrox）蛇毒类凝血酶 从矛头蝮蛇的两个亚种蛇毒中分别分离出两种类型的蛇毒凝血酶，即蛇毒凝血酶I和蛇毒凝血酶II，其分子量分别为29000和31400，蛇毒凝血酶I也是一个糖蛋白，含27%的碳水化合物，蛇毒蛋白酶和Ancord一样，都能引起血浆的去纤作用，作用于纤维蛋白原后也释放出3个纤维蛋白肽，这3个肽都是A链的产物。 蛇毒凝血酶和Ancord的作用很相似，都能释放纤维蛋白肽A，但不能释放纤维蛋白B。这是与凝血酶的不同之处，但蛇毒凝血酶和凝血酶都能活化因子XIII而形成稳定的纤维蛋白块，而Ancord却无此作用。对凝血酶、Ancord和蛇毒凝血酶在作用部位上的区别也曾进行了观察，纤维蛋白原经溴化氰处理后，用其所产生的片段为底物时，凝血酶、Acord和蛇毒凝血酶都能释放出纤维蛋白肽A和AP，凝血酶和蛇毒凝血酶还能释放Gly-Pro-Arg，但Acord却无此作用。 另有报道矛头蝮蛇毒类凝血酶Batroxobin分子量37000，等电点PH6.6，E0.1%280nm10.5，糖含量10.2%，NH2末端为Val,最适PH8～8.5，合成抑制剂有DFP、PMSF。 东部菱斑响尾蛇（Crotalus adamanteus）蛇毒类凝血酶（Crotalase） Crotalase也是一种糖蛋白。分子量32700，含糖量5.4%，E1%280nm14.8，NH2末端为Val,最适PH7.8～8.0，合成抑制剂有DFP、TLCK，它可直接作用于被纯化的纤维蛋白原和血浆中的纤维蛋白原，形成不稳定的纤维蛋白块。此酶不能活化外源系统的因子，不能活化内源系统的其他因子，当与血浆保温后，除了纤维蛋白原外其他因子都没有明显的变化，其活性不被肝素所抑制。此酶对碱性氨基酸酯和几种N-卡氧羰基氨基酸的对肖基苯酯具有酯酶活性，凝固和酯酶活性都被DFP所抑制。酶分子中二硫键的还原能导致酶活性丧失，说明二硫键对其活性是必须的。 南方铜头蝮蛇毒类凝血酶 从南方铜头蝮蛇毒中分离出一个促凝组分，分子量为100000，能直接凝固纤维蛋白原，同时具有蛋白水解、酯水解和酰胺酸活性。该组分与纤维蛋白原作用后，释放出纤维蛋白肽A和纤维蛋白肽B，与凝血酶不同的是释放B肽后释放A肽，而且只有当A肽出现相当量后才发生凝固。大豆胰蛋白酶抑制剂可部分的抑制其活性，但水蛭素对其无抑制作用，肝素能阻断其纤维蛋白的形成。在钙离子存在的情况下，该促凝组分可使血小板发生凝聚。 冲绳烙铁头蛇毒类凝血酶 从冲绳烙铁头蛇毒分离出的凝血酶样酶也是一个酸性糖蛋白，分子量为35000，具有一定的酯酶和弱的酪蛋白水解活性。此酶对转变纤维蛋白原为纤维蛋白有较强的催化活性，其产物主要是纤维蛋白肽A，有少量的纤维蛋白肽B产生。同样不能活化因子XIII，是一个丝氨酸酶，可被DFP所抑制。 从加蓬咝喹蛇毒中分离出的凝血酶样酶也能释放纤维蛋白肽A和B。台湾的棕点竹叶青蛇毒及黄丝烙铁头蛇毒中的凝血酶样酶也已被分离纯化。 总之，蛇毒中的凝血酶样酶已在蝮属、矛头蝮属、响尾蛇属有烙铁头属的十多种蛇毒中都有所发现。 如上所述，纯化的类凝血酶与凝血酶的物理化学性质相似，均能水解纤维蛋白原生成纤维蛋白单体等，功能有很多相似之处。但它与凝血酶不同之处是，水解纤维蛋白原时仅释放一种纤维蛋白多肽A（或B），不激活凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ，由于不激活第XIII因子，生成的纤维蛋白单体不能聚合，因而容易分解从血循环中消除。 活性及应用 此酶与α-凝血酶不同，不能活化V因子、VIII因子，不被血中的蛋白酶抑制剂抑制，对血液凝固系统不但不产生作用，反而促进纤维蛋白的形成，诱导纤溶的产生，因此不仅可作为止血剂，也可用为血栓的溶解剂。 浙江产蝮蛇蛇毒类凝血酶静注家兔后使血浆凝血酶时间显著延长，这是由于血浆纤维蛋白原的水平下降及其性质上的变化所致。表现在对瑞斯托菌素（Restocetin）的亲合力显著降低。此凝血时间之延长可被甲苯胺蓝部分纠正。葡萄球菌猬集试验（SCT）表明，体内有大量纤维蛋白降解产物产生。体外实验表明该酶不激活FXIII。 国产蝮蛇类凝血酶制剂抗栓酶有下列作用。体外抑制ADP诱导的血小板凝集及ATP释放功能。使血中6-酮-前列腺素F1a浓度升高，TXB浓度略减。T/K值减小。静注0.05U/kg时使猫冠状窦血流量增加15.33%.抑制老龄大鼠血浆的脂质过氧化作用于，说明它有防止血管内皮损伤，促进血管内皮细胞生成前列环素及抗血栓作用。用狗实验表明，有溶解冠脉血栓作用。 临床观察证明，对脑血栓、冠心病、心肌梗塞及血栓闭塞性脉管炎等疗效较好。对震颤性麻痹综合症、肌萎缩侧索硬化症及皮肌炎等也有效。 蚯蚓纤溶酶 近年来日本美原恒从蚯蚓提得纤溶酶，但尚未见到公开发表的文献。中国路英华等从锯齿远蚓（Amythas dancatala）、周元聪等从赤子爱胜蚓（Eisenia foelida）分出纤溶酶。蚯蚓的种属不同，酶含量和酶活性不同。如湖北环毛蚓（Pheretia praepinguis）、锯齿远蚓、太平二号蚓、及赤子爱胜蚓的蚯蚓纤溶活性分别为45000、45000、28000及21000U[103] 实验证明[105]，蚯蚓纤溶酶不仅对体内、体外血栓和纤维蛋白有显著溶解作用，而且使血浆纤维蛋白原含量下降和裂解产物增加。由于它是一种纤溶酶，可直接溶解纤维蛋白和纤维蛋白原，并且有活素样作用，可激活纤溶酶原为纤溶酶。由于蚯蚓纤溶酶原料资源丰富、价廉、安全无毒、口服有效，有希望作为新溶栓药物应用于临床。 赤子爱胜蚓纤溶酶 从赤子爱胜蚓中得到3种纯纤溶酶。 蚯蚓纤溶酶有较强的蛋白水解活性，它能被慈菇蛋白酶抑制剂如PMSF所抑制。底物专一性类似于血纤维蛋白溶酶，除作用于蛋白质底物（如酪蛋白）外，还能水解碱性氨基酸及酰胺。B-VIII-2对血纤维蛋白溶酶常用的专一底物Chromozym P有较强的水解作用。蚯蚓纤溶酶不仅能直接作用于纤维蛋白，还能使残留在纤维蛋白原中的纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶，从而增强蚯蚓纤溶酶对纤维蛋白，平板的水解作用。P-VIII-2对组织纤维蛋白溶酶原激活剂的专一底物S-2288有较好的水解作用，相应的尿激酶基本无作用。 蚯蚓纤溶酶 经兔实验表明：口服和静注一定剂量可加速急性肺动脉栓塞的溶栓效应。纤维蛋白试验点样一定剂量3.5h后，蚯蚓纤溶酶与尿激酶的纤溶活力相似。此外它使兔血浆纤维蛋白原含量下降，兔凝血时间、复钙时间及凝血酶原时间均延长。 锯齿远蚓纤溶酶[103] 纤溶酶活性主要集中在蚯蚓内腔消化道，从电泳分析看，活性集中在2～7万分子量的纤溶酶。用硫酸铵分级沉淀，葡聚糖凝胶过滤等方法提得两种纯酶，分子量分别为22800±2000、40400±2000（S D S聚丙烯直板电泳），等电点在3～5之间，最适PH8左右。有直接纤溶活性，不仅能水解人工制成的血纤维蛋白，对天然凝血块也有溶解作用。能间接激活纤维蛋白酶原，有明显的抗凝作用。能水解酪蛋白及人工合成底物TAME等，但对BAEE、BAME无作用。LBT、TLCK、EDTA、苯甲脒、DFP等对蚯蚓纤溶酶有抑制作用。 此外来源于脑的磷酸凝血质致活酶（Tristin）可治疗内脏出血和白血病。来源于胰的喹啉分解酶（Quinoline decomposable enzyme）治疗心脏病。来源于猪粘膜的VB12释放酶（VB12 releasing enzyme）治疗恶性贫血，来源于血管的血管激酶（Angiokinase）有纤溶作用，用于治疗血栓等 溶菌酶（Lysozyme,Mrcopeptide-N-acetylmuramoylhydrolase,Muramidase,Mucopeptide glycohydrolase,EC3.2.1.17） 溶菌酶是糖苷水解酶。作用于N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）及N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分水解，因而具有溶菌能力。也为β-1，4-N-乙酰已糖胺酶。 它广布于人体心、肝、脾、肺、肾等多种器官组织中。其中以肾与肺含量最高，血细胞如单核细胞、巨噬细胞也含此酶，血液与各种分泌物等均含溶菌酶。天然来源以鸟类蛋清含量为丰富。微生物中也存在。它在人体内与其他激素或维生素以复合物形式存在。此酶由粒细胞与单核细胞持续合成与分泌，由于它对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，因此是人体非特异性免疫中一种重要的体液免疫因子。 对溶菌酶的研究是从1907年Nicolle发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始的。两年后NameHKOB曾指出鸡蛋清的杀菌作用是一种酶。1992年Fleming发现人的鼻涕、唾液、眼泪等有强力的溶菌作用并分离得到一种酶，命名为溶菌酶。1945年Alderton等从鸡蛋清中分出溶菌酶结晶。 鸡卵白溶菌酶是了解最清楚的酶种之一。是唯一先从X射线衍射分析解释结构与功能的酶，并搞清了立体结构与作用底物的结合形式。近年来已分出多种来源不同的溶菌酶。确定了其中某些酶的一级结构。 活性及应用 溶菌酶具有各种不同和生理生化作用，包括非特异性的防御感染免疫反应、血凝作用、间隙连接组织的修复、参与粘多糖的生物合成代谢及抗菌作用等。 抗菌消炎 溶菌酶之所以对革兰氏阳性菌有杀伤力，就是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷壁质组成，其中占主要成分的胞壁质又是由杂多糖与多肽组成的糖蛋白。而这种杂多糖正是由N-乙酰胞壁酸与乙酰氨基脱氧葡萄糖以β-1，4糖苷键相连。溶菌酶可水解这个糖苷键使细菌失去细胞壁而破裂。 葡萄球菌或溶血性链菌腹膜内感染的小白鼠，分别投与氨卡青霉素并用鸡卵白溶菌酶，结果后者使生存率上升。由于它能分解粘厚的粘蛋白，消除粘膜炎症，分解粘脓液，促使粘多糖代谢及清洁上呼吸道，所以临床上主要用于五官科多种粘膜疾患。如治疗慢性副鼻窦炎、小儿副鼻窦炎、中耳炎、过敏性鼻炎及口腔炎等粘膜炎症。也用于慢性支气管炎的祛痰、鼻漏及耳漏等粘脓液的排出。 与抗生素合用有协同作用，可增强疗效常用于难治的感染病症。它也能影响消化道细菌及皮层的渗透力，用于治疗溃疡性结肠炎。也可分解突变链球菌的病原菌用于预防龋齿。也用于咽喉炎、扁平苔藓、渗出性中耳炎及牙周炎等。对由抗阳性菌及需氧细菌性死物寄生菌引起的炎症也有效。 抗病毒 作用与干扰素有类似之处，与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐。试管内Hela细胞被疱疹病毒感染的培养液，加溶菌酶后有抑制细胞变性作用。也可抑制腺病毒生长。可用于带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治疗。 其他医疗用途 腹膜内接种吉田肉瘤（1×106个细胞）的大白鼠及接种Ehrlich's腹水癌的ddy系小白鼠，连续给鸡卵白溶酶后能提高生存率。有少数报道溶菌酶曾用于癌症的止痛及防治癌病患者化疗或放疗等引起的白细胞减少。 具有抗血纤蛋白溶解作用。防止毛细血管出血、强化血管壁，用于鼻出血、血痰、咯血、血尿及术后出血等场合。 食品添加剂 溶菌酶是一种无毒性的蛋白质，从而也是一种安全性高的食品杀菌剂。已用作育儿奶粉的添加剂。它仅分解目的微生物的细胞壁，而不与其他物质作用，特异性高。不能分解芽胞。可与其他防腐剂并用。 工具性试剂及诊断试剂 由于分解微生物细胞壁的专一性较强，所以此酶可用于了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁制造原生质体和原生质球状体。也可用于微生物的分类。 人体组织和体液中均含有溶菌酶，它在其中的水平与机体的生理状况有关，它能反映某些组织的病变。尿液中此酶的含量可作为肾移植排斥、肾肿瘤、各种肾病和白血病的早期诊断，以及肿瘤病人由于放疗所引起的辐射病的早期诊断。测定血清及尿中溶菌酶对诊断单球性白血病，测定粪便溶菌酶对诊断溃疡性大肠炎及肝病等，均可提供依据。 透明质酸酶（玻璃酸酶，Hyaluronidase,Hyaluronoglucosaminidase,Hyaluronate 4-glycanohydrolase,Mucinase,Spreading factor,Hyaluronoglucosidase,EC3.2.1.35） 因它水解的底物为透明质酸（也称玻璃酸），故又称玻璃酸酶。它广泛存在于哺乳动物睾丸（主要来源于牛羊）、蛇毒、蜂毒及细胞的溶酶体中。也存在于精子、颌下腺及细菌中。睾丸、蛇毒、溶酶体及细菌的透明质酸已分别提纯并对其性质已有研究[129]。中国药典1990年版收载了本品。 活性及应用 结缔组织基质中的透明质酸具有较大的粘滞性，有滑润保护作用，对于体液扩散还有阻滞作用。透明质酸酶通过对粘多糖透明质酸的解聚作用，能加速物质的扩散和吸收，促使皮下注射液或局部积贮的渗出液、血液等的扩散和吸收，是一种重要的药物扩散剂，也有消除血肿和水肿的作用。它主要用于加速药的扩散与吸收，与其他注射液（如生理盐水、抗生素、肾上腺素等）合用时，可促使皮下注射液迅速被吸收。本品还能促使局部麻醉剂的扩散，与造影剂合用有利于X-线诊断。 据报道，自1959年Oliveira等[130]首次用透明质酸酶减轻心肌梗塞病人及狗的缺血损伤后，已有大量实验研究[131，132]及临床观察[133，134]。证明此酶确能减轻缺血损伤和缩小心肌梗塞范围。通常认为透明质酸酶与促进底物供应和废物转运、减轻血管破坏和细胞水肿及增加侧枝扦环等作用均有关。 睾丸中的透明质酸酶存于精子的先体中，受精时它可能水解卵子的被膜，有助于精子的进入。来源程序于睾丸的透明质酸酶为异种蛋白，有时间产生副作用如休克、睾丸变性萎缩等，现多不用。 在生化方面，此酶可用于透明质酸及硫酸软骨素的鉴定。 此外它也有促扩散、化痰及消肿等作用，也有用于肠粘连及青光眼等症。 糜蛋白酶（Chymotrypsin） 是典型的丝氨酸蛋白酶。有消化脊椎动物食物的功能。在胰内先合成其前体糜蛋白酶原，分泌于胰液中，并于肠内被胰蛋白酶及糜蛋白酶限定分解，成为多种形式的糜烂蛋白酶。胰液中存在糜蛋白酶原A、B、C经活化为糜蛋白酶A、B、C。牛此酶A及B几乎等量，特异性相似。糜蛋白酶C于牛内构成前羧肽酶的亚单位，于猪中则呈游离状态。它们的系统分别为ChymotrypsinA及B（EC 3.4.21.1),ChymotrypsinC(EC 3.4.21.2). α-糜蛋白一级结构[136]及立体结构[137]已被阐明。对反应机制的研究正在深入进行。 提取分离 一般将鲜胰酶原经自身消化后用0.1mol/L硫酸提取α糜蛋白酶。经硫酸铵分级得蛋白结晶。该结晶多含不纯物，可反复结晶，层析再纯化。胰内含其他多种蛋白酶，可用各自的特异抑制剂分别处理。尤其宜用TLCK处理，使胰蛋白失活。 活性及应用 抗炎抑制浮肿 尤其适用于炎症第一期。可使血液中纤维蛋白溶解酶原变成纤维蛋白溶解酶。除去大部分纤维性渗出物的阻塞，使血液和体液畅通。也由于它选择性地水解由芳族或脂族氨基酸（如苯丙氨酸，酪氨酸）所组成的肽键，液代脓液及分解坏死组织。从而增加白细胞的游走及吞食作用，促使炎症消除。此外糜烂蛋白似有激肽（Kinin）样作用，使微循环毛细血管壁扩张，从而促进组织向静脉端回收水分而消除水肿。由此可见，糜蛋白酶的抗炎消肿机制与甾体激素及抗生素的作用机制是不同的。与甾体激素相比较，糜蛋白酶可选择性地抑制和再吸收发炎部位的水肿液，同时并不影响白细胞的活动，也不产生类似甾体激素所引起的柯典氏症状。 与抗生素比较，由于胰糜蛋白酶的抗原基团不是在酶的活性中心，因此酶的活力不受抗酶的影响，长期使用时机体也不会产生抗生素那样抗药性。 大鼠皮下注射糜蛋白酶具有抑制卵蛋白所致的浮肿作用。临床证明，对各种炎症、炎性水肿、血肿、粘连、溃疡及血栓等疗效较好。如对创伤感染（切口、创伤、冻伤、压伤）、创伤性溃疡（包括癌性溃疡、褥疮）、术后粘连（腹腔手术粘连、炎症粘连）血栓性静脉炎、脉管炎、胃炎、胃十二指肠溃疡、宫颈炎、附件炎、盆腔炎及急慢性中耳炎等均有疗效。对慢性泪道阻塞近期疗效也好。 分解粘液 液化粘稠的粘液和粘蛋白，使痰液变稀，使支气管畅通，也是有效的祛痰药物。 抗癌 此酶可使肿瘤部位粘性降低，通透性增加，血液畅通。局部大剂量使用时，这种作用更强。胰糜蛋白酶同抗癌药物合用时，能促进抗癌物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用从而提高疗效。在抗癌增效上有效率高于50%。 据报道大剂量使用蛋白水解酶可治各种肿瘤（如乳腺、卵巢、子宫、膀胱、胃、皮肤、直肠、支气管、淋巴肿等），并且无任何副作用或不良反应。早期使用局部注射蛋白制剂，采用足够的剂量，甚至体征有明显缓解之后再继续使用，将会有更明显效果。肿瘤细胞膜的缺陷能被蛋白水解酶通过，从而对肿瘤组织起选择性的破坏作用。 此外，胰蛋白酶或糜蛋白酶可使运动迟缓素原激活成运动迟缓素，使胰血管舒张素原激活成胰血管舒张素，引起血压下降。毒蛇咬伤后立即在原部位注射胰蛋白酶，还有显著解毒作用[143]。 该酶的用药方式有肌肉注射、喷雾吸入、局部外敷及灌注等。副作用主要在于异性蛋白进入体后可能会引起抗原抗体反应。个别病人也可能产生。如在给药前先用抗组织胺类药物预防，反应可以减轻。 此酶也可用于蛋白质一级结构解析时的分解剂。 商品有牛糜蛋白酶原A、α-糜蛋白酶，也有经TLCK处理固定化的糜蛋白酶。 胰蛋白酶（Trypsin,EC3.4.21.4） 是典型丝氨酸蛋白酶。有消化脊椎动物食物的功能。在胰内先生物合成其前体胰蛋白酶原，分泌于胰液中，并于小肠内经胰蛋白酶自身消化而激活。肠激酶（Entrokinase）也能使其激活。牛胰蛋白酶于活性化同时产生数种活性分子种。即将胰蛋白酶原N-末端脱下六肽而活化为β-胰蛋白酶，再将分子内的Lys131-Ser132切断，产生α-胰蛋白酶，将Lys176-A-sp177,Lys131-Ser132两者均切断产生ψ-胰蛋白酶。胰蛋白酶一般多指β-胰蛋白酶而言。 胰蛋白酶是蛋白酶中特异性最严密的酶。只作用于碱性氨基酸C末端肽键。近年于微生物（streptomyces）、血液、昆虫、海星中也发现有类似物。胰蛋白酶除具有肽酶作用外，也具有酯酶及酰胺酶作用。它的一级结构及立体结构已被阐明。对反应机制也有较详尽的研究，性质与糜蛋白酶也极类似。 活性及应用 在消化管内消化蛋白质，也是胰酶前体（糜蛋白酶原、胰蛋白酶原、前酯酶、前羧肽酶A及B、磷脂酶原等）的活化因子。 胰蛋白酶与糜蛋白有类似的药理作用和临床应用。主要用于肺脓肿、支气管炎等使分泌物稀薄易咳出，溃疡、坏疽、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿的消肿，以及血肿、浓肿、关节炎、粘液囊炎、血栓静脉炎、虹膜睫状体炎、眼色素层炎、粘膜炎等的抗炎消肿。此外，胰蛋白酶及糜蛋白酶等还有扩张血管作用，能改善包括炎症部位在内的全身性循环，有益于缓解局部充血和促进其他药物的吸收，能改善包括炎着部位在内的全身性循环，有益于缓解局部充血和促进其它药物的吸收，从而提高配伍药物的疗效。毒副作用较低，对肝肾功能也未见明显影响。 胰蛋白酶及糜蛋白酶的粪中浓度也可作为成人重症胰不全诊断的一种依据。粪中胰蛋白酶及糜蛋白酶活性测定也有助于对胰一次闭锁及小儿胰纤维症的诊断。小儿脂肪症时既或十二指肠的胰蛋白酶浓度正常，有时粪中浓度降低。 胰蛋白酶有高度的特异性，可限定分解蛋白质，可用于一级结构解析。 结晶糜胰蛋白酶1963年戚正武等[147]首先从猪胰中获得了两种结晶蛋白质：A和B。经分析证实两者都是糜蛋白酶和胰蛋白酶的混合体。这种不同专一性的两个酶蛋白在不同条件下如此紧密的结合在一起的现象，在结晶酶中还是少见的。后来，中国科学院上海生化所和江苏吴县制药厂合作，于是976年研制成功注射用结晶糜胰蛋白酶[148]，这是中国独创的酶制品。 活性及应用 结晶糜胰蛋白酶具有两种酶协同水解蛋白质肽键的作用。其药理作用与从牛胰中制取的胰蛋白酶和α-糜蛋白酶基本相同。比单独使用一种酶的效果更好，适用范围更广。对各种炎症、炎性水肿、粘连、溃疡及血栓等均有较好疗效。 胰蛋白酶抑制剂（抑肽酶，Trypsin Inhibitor） 是一种小分子蛋白质。抑肽酶是它的药用商品名称，国外同类产品名如Trasylol、Iniprol、Pantripin等。已经证实，从牛的各种组织（胰、肺、颌下腺等）中提取的激肽释放酶抑制剂就是早先Kunitz从胰腺中提取的胰蛋白酶抑制剂。它是一多功能抑制剂，能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纤维蛋白酶及各种组织或血浆激肽释放酶 。已广泛用于治疗急性胰腺炎，烧伤后的休克及产后大出血等疾病，有独特的疗效。 Kunitz胰蛋白酶抑制剂分子量6000，由58个氨基酸残基组成，它的一级结构和二级结构均已阐明，分子内有3对双硫键，其中一对双硫键（14-38）位于分子表面，它使两段肽链（32-42，9-21）连接在一起，这一对双硫键被还原和重新氧化后不影响抑制剂活力。另外两对双硫键（5-55，30-51）位于分子内部，一旦还原后即失活。整个分子呈梨形，长29A，中部圆形部位直径19A。其活性中心为赖氨酸，位于分子的顶端。 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD,Superoxide oxidoreductase, EC 1.15.1.1) SOD是一种新型酶制剂，属金属酶。分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。正常情况下仅存在于细胞溶质中。存在于高等动物的红细胞、肝、脑组织中。在微生物中主存于需氧菌。SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类。它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。因而受到医药界的关注。目前中国国内已进入临床试验阶段。 超氧离子是氧分子获得一个电子而形成的负一价自由基。在生物体内它可产生于某些酶的酶促反应过程中，如黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、二氢乳清脱氢酶、半乳糖氧化酶、色氨酸二氧酶及黄素蛋白脱氢酶类所催化的反应。在儿茶酚胺、氢醌、肾上腺素、巯基基团四氢喋呤等物质的氧化过程中也产生并释放出超氧离子。另外，在生物体遭受电离辐射时，在吞噬细胞吞噬消灭外来微生物的过程中，都会产生大量的超氧离子。所以，在需氧生物体内，随时都有大量的超氧离子生成。 超氧离子具有较高的化学活性，对生物细胞具有一定的毒性。它可与过氧化氢反应，生成毒性更强的羟基自由基（·OH）。超氧离子与羟基自由基进攻生物膜，可改变膜的结构和通透性；进攻染色体，可使染色体降解、断裂。它们还可攻击许多细胞内成分，使其失去生物活性和功能。所以，如果生物体内或某一组织中超氧离子含量异常高，就会引起疾病，甚至死亡。幸而，生物体内的超氧化物歧化酶在高速清除机体内随时产生的超氧离子。 一、提取分离 SOD的制备方法随原料而异。目前国际上制备SOD的原料有：动物血、微生物和动物组织。作为药物大都是以血球为原料提取Cu·Zn-SOD，即使以富含Mn-SOD的牛肝为原料，在生产中也要通过螯金属离子制成Cu·Zn-SOD。目前中国动物血如牛、羊、猪血大都未被利用，如若综合利用动物血中提取SOD，则具有一定实际意义。 二、活性及应用 目前一般认为生物体利用分子氧的第1步是通过NADH（还原型辅酶Ⅰ）或NADPH（还原型辅酶Ⅱ），在超氧阴离子合成酶作用下首先形成O2-·，然后再发生一系列氧化反应。分子氧本身毒性很低，但它的还原产物活性氧对细胞毒性却很大，由于活性氧能使体内的成分氧化，因此造成一定的生物损害。在生物体内产生O2-·的途径很多，如黄嘌呤氧化酶、酵母t-RNAlys连接酶、吞噬多形核细胞、FMN、IgA、IgG、表面活性剂PMA、高能辐射以及卡红霉素、斯帖菲霉素、丝裂霉素C和争光霉素等抗生素都能产生O2-·。尽管生物体在无时无刻地产生O2-·，但由于细胞内存在一种高效的“清除剂”——SOD，因此生物体仍能维持正常的生理功能。在病理的情况下能否通过补充外源的SOD达到防病治病的效果这是大家所关注的，虽然这方面报道较多，但大多数仅处在动物试验阶段。 生物体内不少病理过程都能产生超氧离子。首先应了解超氧离子在各种氧-氧键中的地位，氧-氧键共有4种。 超氧离子的产生 超氧离子对人体的毒性很大，对细胞的破坏力极强。不少疾病对人体的致命性，产生超氧化物也是原因之一。以下几方面能产生超氧离子： 发炎 不少炎症已证实能产生超氧离子，如类风湿性关节炎、骨关节炎、腿部水肿等。肺炎、肺水肿由于处于富氧的肺部，更易产生超氧离子。 电离辐谢 机体经电离辐射后会产生有毒的超氧离子，这是辐照病（放射病）的致命原因之一。 据Pethan等人报道，SOD可提高辐照动物的存活率，Huber等人报道每天注射2mg/kg的SOD可降低自身免疫鼠的抗体滴度；Robbins等人报到每天静注105μg/g可抵抗由SOD抑制剂链脲佐菌素所引起鼠的糖尿病；Leuthauser和Larry等人初步证明无论单次静注或肌注SOD，均能延长患有腹水癌鼠的寿命。 超氧化物歧化酶近年来在国际上受到广泛的重视，这是因为它可以作为治疗酶，对不少较为难治的病有一定的疗效。国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶。其商品名为Orgotein。不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。作为治疗酶的超氧化物歧化酶有以下功能。 对自身免疫性疾病的治疗作用 SOD对自身免疫性疾病一般均有疗效。例如Crohn's疾病也称回肠结肠炎。这是一种肠道自身免疫性疾病，极为顽固。但有不少例子说明经过每天500mg剂量的SOD处理（皮下注射）2个月内症状消失。 胶原性的自身免疫性疾病即所谓胶原病，例如红斑狼疮、皮肌炎、类风湿性关节炎等，以前都没有有效的治疗方法，现在用SOD处理，均可获得缓解和治愈。在各类胶原性疾病中，包括硬化（Sclerosis）、红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎以及结节性动脉外膜炎等的细胞中，均可发生染色体断裂，这与疾病产生的超氧离子有关。实验证明，超氧离子不但可引起染色体断裂，还可造成染色体重组，引起严重恶果。但经过一个阶段的SOD治疗，染色体断裂现象消失。 对其他炎症及水肿的疗效 SOD对肺炎有特效。因为肺经常充满氧气，因而患有细菌性肺炎时，就更易产生超氧离子。肺因而受到侵害。如用SOD静注处理，可得预期的效果。些外SOD对各类过敏性引起的水肿——如抗血清引起的皮肤水肿，角叉菜聚糖（Carraeggnan)引起的脚部水肿以及其他炎症性水肿均有一定疗效。对各类细菌引起的发炎也有很好疗效。 辐射产生的O2-·及OH·作用于细胞膜，使细胞膜的脂类物质发生过氧化反应，则改变了膜的结构和离子的通透性，使大量K+外流，导致细胞的溶血破裂。有人证明，腺粒体膜的脂质过氧化是由Fe3+、ADP及O2-·的作用造成的。微粒体膜的脂质过氧化主要是与O2-·的作用有关。所以在生物体遭受辐射时，SOD具有保护机体的作用。 已经发现放射病患者的染色体有断裂现象，从这一点看，其起因与胶原病患者相同。 对放射病的疗效 经受高剂量X-射线或γ-射线照射所得的放射病，一直苦于没有好方法治疗。放射病引起的致命症状，多半是超氧离子造成的。SOD对各类放射均有较好的疗效，SOD并可在临床实践中用作治疗性辐射的预防保护剂。 人体白细胞对外部入侵的细菌吞噬时能产生微量的超氧离子杀死病菌，剩余的有毒超氧离子被人体的超氧化物歧化酶分解，而不会损害机体。 肿瘤SOD含量异常，在动物细胞中Mn-SOD常用较大的下降，而人体肿瘤中其含量仅稍低于正常组织。有人认为干扰素充分发挥抗病毒作用需有SOD的存在。 SOD可作为皮肤化妆品使用，防止皮肤色素形成和沉着，有使皮肤色素分解及退色的效果。与还原物质合用有加成效果。 有人发现，防御氧代谢毒害作用愈强的动物生命愈长。 作为药物SOD有否毒性，这是人们十分关注的。前已提到SOD是生物大分子，分子量在3万以上，因此这就带来抗原问题。临床试验表明，SOD毒性和副作用却很小，这可能有下面3个原因：①SOD的氨基酸组成特殊，以牛血SOD为便，它约有265个氨基酸，其中将近30%是极性氨基酸，而且分子中芳香氨基酸极少，只有4%左右，加上分子十分紧密，因此SOD的溶解性也特别好。②SOD在体内代谢速度很快，有人测其在体内停留时间，发现6h只剩原注射量的10%左右，90%以上的SOD经降解而随尿排出；有人测其体内的半衰期只有6～10 min，可见SOD在体内代谢的速度是很快的。③不同来源的SOD其分子量不仅接近，而且氨基酸的顺序也有一定相似性，更有趣的是它们在免疫上相互之间存在一定的杂交性。因此一定量的外源性SOD进入体内不会严重干扰原有细胞的生理功能。迄今为止，不管SOD用于人还是用于动物，也不管何种给药方式，对人和动物的精神、睡眠、血压、心、生殖和肠胃系统的生理功能均未发现有任何副作用。 细胞色素C （细胞色素丙， Cytochrome C) 细胞色素C是一种以铁卟啉为辅基的呼吸酶，是细胞呼吸激活剂，属于络合蛋白质。由多肽与血色素络合而成。血色素是铁的衍生物，具氧化还原的可逆性，从而导致细胞色素α能在生理氧化反应过程中表现出电子传导，即Fe2+→←Fe3+的效能，以促进细胞的氧化反应，达到兴奋呼吸目的。它在生物氧化过程中，是一个非常重要的电子传递体。马心是常用的提取原料。猪、牛、羊、兔心均含此酶，鲐鱼肉含0.0138%，鲐鱼心含0.0018%。鲨心及骆驼心均含有。 活性及应用 细胞色素C是有效的电子传递体，对因组织缺氧引起的一系列症状，起到矫正细胞呼吸与物质代谢作用。 临床上细胞色素C主要用于治疗因组织氧化还原过程障碍及因组织缺氧所引起的一系列疾病，如改善脑血管障碍、脑出血、脑外伤、脑动脉硬化、脑栓塞、中风后遗症等引起的氧缺乏诸症状；治疗一氧化碳中毒、催眠剂中毒、新生儿假死、视神经症以及因心脏代谢障碍、心绞痛引起的心肌组织缺氧等。也可应用细胞色素C治疗因支气管哮喘和慢性肺炎所致的肺功能不全。有报道对进行性肌肉萎缩症也显较好疗效。其肠溶衣口服片对放疗和化疗引起的白细胞降低等也有改善作用。 细胞色素C在一定条件下可以吸收、转运和进入靶细胞膜。氧化型细胞色素C对线粒体亲合力及心肌固着力均比还原型细胞色素C为好。两者氧化还原的情况也不相一致，在生物学效应方面还原型细胞色素C远不及氧化型细胞色素C。细丙具有催化O2-·的作用形成O2-·/O2循环，这很有实际意义，可考虑扩大临床应用于抗炎、抗衰老等方面。 磷酸脂酶（Phospholipase A2, Phospholipase A1, Lysophoslipase, Phospholipaes C, PhospholipaseD) 磷酸脂酶是磷脂质的水解酶，水解甘油磷脂质及神经鞘磷脂质。由于被水解的甘油磷脂质的酯链位置不同而命名为A1，A2，C，D。水解溶血磷脂质的脂肪酸酯的酶被称为溶血磷脂酶。水解磷脂质C-1位及C-2位双方酯链生成2分子脂肪酸及1分子甘油磷酸衍生物的酶，传统称为磷酸脂酶B，它与溶血磷脂酶同样对待。 在磷脂酶A（A1及A2）方面，对蛇毒及哺乳类胰磷脂酶A2的研究较深入。它们的一级结构已被确定。胰酶是胰液的消化酶，一般以前体形式存在，由胰蛋白酶水解成活性型。磷脂酶A为细胞内酶，存在于哺乳动物几乎所有的脏器及细胞中。一般认为它参与膜磷脂质的代谢。 溶血磷脂酶广布于细菌及动物细胞中。同一酶不仅作用于溶血磷脂质，对磷脂质多数也显示活性。对来源于牛胰的肝酶研究较多。磷脂酶C也广布于动物细胞中，多数特异地作用于磷脂酰肌醇，分类属于—磷脂酰肌醇磷酸二酯酶（EC3.1.4.10)。 磷质酶D除广布于胡萝卜、洋白菜等植物组织及微生物外，动物细胞（大鼠脑、人嗜酸球）也含有。除水解磷脂外，尚有向伯醇磷脂酰基转移活性。 活性及应用 胰酶在肠液中消化脂肪、蛋白质和淀粉，使这些营养成分被细胞吸收和利用。助消化药。主用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍。也适用于先天性胰功能不全（儿童和青少年胰脏发生囊性纤维病变引起胰功能不全）、腹部手术和外伤胰腺切除导致的胰功能不全、未经手术切除后天引起的胰功能不全及酒精中毒的慢性胰腺炎等。 胰酶制剂不能提高原发性胰分泌不足，而只是对酶分泌量不足的补充。口服胰酶制剂应防止胃酸对酶的破坏。应服其肠溶衣制剂。近年来开发的胰酶微囊制剂，临床应用似有一定前途。 此外，它也可作为治疗糖尿病的辅助药物。6个月后婴儿抗体减退、脂肪代谢紊乱、皮肤干燥、视力减退及支气管炎等病人也可用胰酶。它也是老年保健药物之一。因它具有降血脂促进维生素A、E、B12吸收等作用。 蛋白质多肽激素 激素是一类动物体内的化学信息分子。动物激素是指由动物腺体细胞和非腺体组织细胞所分泌的一切激素。蛋白质多肽激素包括由丘脑、脑垂体、胰腺、甲状旁腺、甲状腺、胸腺、胃肠道、肾、胎盘、睾丸、卵巢及其他非腺体组织所分泌的多种激素。 尿激酶 自Mactarlane (1947) 发现尿中有溶解凝血作用的物质之后，1952年Sobel对该物质进行了研究，并命名为尿激酶。UK是由肾细胞产生的一种纤维蛋白溶酶原激活剂。属一种碱性蛋白质的丝氨酸酯酶。有多种分子量形式，主要有31300及54700。存在于人及哺乳动物尿中。鲜尿中几乎是大分子量尿激酶（HUK），小分子量尿激酶（L-UK）是其降解产物。人尿中UK平均含量5～6IU/ml。也可由肾细胞培养法制取L-UK。临床实践表明，H-UK治疗血栓症的效果比L-UK好。动力学研究也证明，H-UK激活其天然底物溶纤酶原（PG）的米氏常数（Km）仅为L-UK的一半。 通过Sephadex G-100、Sephadex G-75、SP-Sephadex C-50系列柱层析，纯化的人尿尿激酶分为两种活性形式。它们在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶梯度电泳及Ouchterlony's双向免疫扩散法皆呈均一组成（pI为8.7、8.9、9.1、9.2、9.4)，L-UK也有同样数目的亚形式（pI7.5、8.3、8.8、9.4、9.7)。具有最高比活的H-UK亚形式PI为9.4，L-UK亚形式为pI8.3及8.8。有人认为精制后的UK亚形式不符合体内的形式，是精制过程中的赝象。 树脂吸附法制取UK 碱化除沉淀 将男性尿用5mol/L氢氧化钠调pH至碱性，静置1h，虹吸上清液，弃去白色沉淀。 树脂吸附UK 将虹吸的上清液用5mol/L盐酸调pH，加树脂，搅拌1.5h，树脂自然下沉，收集吸附有UK的树脂。 洗涤 用0.1mol/L pH5.5的磷酸缓冲液（上清液体积的10%）搅拌洗涤30min，虹吸除去上清液，再以0.1mol/L pH6.4的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤30min，收集树脂。 洗脱 第1次洗脱用氨水搅拌洗脱1.5h，第2次洗脱以同样量的洗脱液搅拌洗脱0.5h，抽滤，收集洗脱液，合并洗脱液，测量其体积。 硫酸铵沉淀 按洗脱液体积加入固体硫酸铵，不断搅拌使其溶解，并使其饱和度达65%，用5mol/L盐酸调pH为8.6，于0～2℃沉淀8h，离心收集，得棕色UK沉淀。 H-UK与L-UK的分离与纯化 将部分纯化的UK300mg(比活1000IU/mg蛋白）溶于10l pH9.0氨水中，加入固体氯化钠调节电导至23mv/cm。将此溶液通过一预先用0.01mol/L磷酸缓冲液-0.2mol/L氯化钠液（pH8.0)平衡的Amberlite-IR938型阴离子交换树脂柱（4×8cm)，流速2l/h。于4℃下收集流出液（无色，比活为17000IU/mg蛋白，活力回收90%)。将流出液用1mol/L醋酸调节pH至4.2，并加蒸馏水调整电导至15.6mv/cm，进行CMC柱层析（2.0×4.0cm）。柱预先用0.1mol/L pH4.2醋酸缓冲液平衡，以20ml/min流速上样，然后用0.1%氨水-0.1mol/L氯化钠溶液洗脱。洗脱液比活为8000IU/mg蛋白，活力回收80%以上。 将比活为8000IU/mg蛋白的UK溶液对0.03mol/L pH6.8磷酸缓冲液透析后参照White法进一步用羟基磷灰石吸附柱层析分离两种UK。羟基磷灰石柱（1.9×2.85cm)用相同缓冲液平衡。样品上柱后用0.1mol/L和0.2mol/L pH6.8磷酸缓冲液分步洗脱，将H-UK和L-UK完全分开。 猪颌下腺K的制备 工艺路线： 水、酸、二甲苯 氢氧化铝 磷酸氢二铵、氨水、氯化钠 乙醇、丙酮 水、醋酸铵 活性炭 猪颌下腺────→滤液────→吸附浆────→洗脱液────→粗品────→溶液────→溶 pH4.5 pH8.4 乙醇，丙酮 液────→精品
工艺过程： 提取 取新鲜或冷冻的猪颌下腺，去尽脂肪，绞碎，每100kg加5倍量水搅拌提取，用醋酸调pH，并加入二甲苯防腐。提取12h，补加二甲苯600ml防腐。保持pH至酸性，提取12h，滤取滤液。 吸附 滤液加氢氧化铝干凝胶3.4kg，搅拌1h后再加此干凝胶1.6kg，搅拌2h，静置过夜，除去上层液。加浆重5倍水搅拌洗涤，待氢氧化铝沉降后，除去上层液，反复洗5～6次，至上液基本澄清为止。 洗脱 除去上清液，加入磷酸氢二铵，用8.6%氨水调pH至8.4，搅拌洗脱2h，按含水量加1%氯化钠，搅拌10min，加入92%以上浓度的乙醇，使含醇量达45%，静置过夜。纸浆过滤，收集滤液。 沉淀干燥 滤液用2mol/L醋酸调pH至6.7，搅拌加入92%以上的乙醇至含醇量为80%，静置，除去上清液，离心。沉淀用丙酮洗涤脱水，真空干燥。 精制 粗品用25倍量醋酸铵溶液溶解，调pH为6.5～6.7，加等量95%乙醇，冷藏静置过夜，离心沉淀，用丙酮脱水，真空干燥，即得。 颌下腺K的提取与纯化 提取 新鲜的颌下腺贮于-20℃，冷冻组织绞碎后加0.1mol/L醋酸溶液在5℃高速匀浆1min(5L/kg组织)，匀浆物在20℃、19000×g离心，分出上清液并用氢氧化钠液调pH7.0。 丙酮分级沉淀 边搅拌边向上述清液中加入预冷至5℃的丙酮，使浓度为35%（v/v），5℃放置过夜，离心除去沉淀，再向上清液中补加丙酮，使其浓度为65%，5℃下连续搅拌2h，同样方法离心，收集沉淀，将沉淀溶于一定量用氨水调pH7.5的水中。 纯化 颌下腺K依次经DEAE-23纤维素吸附层析、偶联了Aprotinin的Sepharose-4B亲合柱层析和DEAE-SephadexA-50柱除核酸纯化，得到的产品经超速离心分析为均一蛋白，在SDS-凝胶上电泳出现两条带，主要成分为KB，另有微量的KA。 注：提取胰α-K时除加0.1mol/L醋酸外，还需加大豆胰蛋白酶抑制剂和EDTA作保护剂。提取物经硫酸铵分级沉淀和反复地吸附层析、凝胶过滤，得到园盘电泳呈单一条带的胰α-K。胰脏匀浆物在一定条件下自溶使酶原活化后，可得到两条多肽链的胰β-K，再经DEAE-纤维素柱层析等一系列其它步骤，可分离到胰β-K的A、B两种形式。 Kira等曾以猪胰脏丙酮粉为原料，用经浓醋酸调pH4.1蒸馏水提取、除蛋白、过两次偶联了牛肺胰蛋白酶抑制剂（BLTI）和大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）的Sepharose-4B亲合柱，然后经两次DAEA-Sep-hadex A-50柱层析，得到3种组分，依其从DEAE-Sephadex A-50柱上洗脱的顺序分别命名为KⅠ、KⅡ，KⅡ，即KⅠ首先洗脱下来，KⅡ与前人报道的KA、KB相近。 猪胰K的提取与纯化 工艺路线： 绞碎、匀浆、室温下自溶18h、加水调节ph→6 55℃加热5mim 冷丙酮至33%、过滤 新鲜去脂速冻猪胰─────────────→上清液──────────→滤液 过滤 硫酸铵介吸 丙酮至 丙酮、乙醚减压真空 ───────→DEAE───────→洗脱液───────→沉淀───────→粗制K丙酮粉 加蒸馏水离心 DEAE层析柱层析 浓缩、脱盐、真空干燥 ───────→上清液───────→收集活力部分───────→猪胰K冻干品 固定化大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及对猪胰K的处理： Sepharose-4B 2g，加蒸馏水150ml，溶涨后置于三孔圆底烧瓶内。取溴化氰2g加蒸馏水80ml溶解，在25℃下加入上述烧瓶内，调节pH至11，搅拌反应6min，过滤，凝胶用0.1mol/L碳酸氢钠冲洗，再用0.05mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH8.0）平衡。 称取大豆胰蛋白酶抑制剂320mg用少量平衡液溶解，加入到上述活化的Sepharose4B中，再用上述平衡液稀释到Sepharose4B/溶液（v/v)=40%，搅拌2h，然后在4℃反应16h，装柱，用平衡液冲洗，再用1mol/L乙醇胺处理以封闭剩余的活化凝胶，然后用0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.0,内含1mol氯化钠）和0.1mol/L醋酸缓冲液（pH4.0，内含1mol氯化钠）反复冲洗，再用蒸馏水冲洗，备用。 猪胰K纯化后的冻干品配制成10mg/ml溶液，缓慢经过处理好的固定化大豆抑制剂柱，醋酸铵缓冲液（pH7.0)洗脱，收集洗脱液，对水透析去盐，真空干燥，得去除蛋白水解酶的猪胰K。 猪胰K的制备 粗品制备 猪K丙酮粉，加20倍量0.02mol/L醋酸，于10搅拌提取12h，离心。渣加10倍量0.02mol/L醋酸提取6h，合并滤液，加冷丙酮至浓度达33%，过滤，滤液补加冷丙酮至70%，静置4h，离心，收集沉淀，用丙酮、乙醚脱脂，脱水，真空干燥。 中间品制备 粗品K加50倍量0.2冷氯化钠液，用氨水调pH8.0搅拌溶解后经纸浆过滤。滤清液冷至2～3℃，加冷丙酮使浓度达40%，冷室装置过夜，离心。清液补加冷丙酮至浓度为60%，静置4h，离心，沉淀用丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得K中间品。 精品制备 将中间品溶于0.001mol/LpH4.5醋酸缓冲液中，离心，清液加入弱酸性阳树脂Amberlite CG-50(钠型）树脂（树脂：中间品为5:1）搅拌吸附2h，收集树脂用0.001mol/LpH4.5醋酸缓冲液漂洗树脂至无泡沫。树脂用2倍量1mol/LpH5.0氯化钠液搅拌洗脱1h，分离树脂，洗脱液透析脱盐，冻干，得精品K，纯度100U/mg以上。 浙江蝮蛇蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化 DEAE纤维素（ED-22）柱层析 称取20g蛇毒丙酮干粉先经70%甲醇抽提粗毒中的激肽增强肽，沉淀部分制成丙酮干粉，溶于约60ml含10-2molEDTA的0.01mol/L磷酸氢二钠溶液中，不溶物离心除去，调至pH8.0，加水稀释至500ml左右，上DE-22柱（5×50cm，预先用0.01mol/lpH7.8磷酸缓冲液平衡），梯度洗脱，第1级取0～0.1mol氯化钠（各6000ml，配于0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液），第2、3、4级分别取0.1～0.2mol氯化钠；0.2～0.4mol氯化钠，0.4～1.0mol氯化钠，均配于同一缓冲液，各取3000ml，流速200ml/h，每瓶收集100ml，在5℃下收集。第2个酯酶峰经生物活力测定，具有激肽释放酶活力，合并第25～45瓶。第3个酯酶峰为类凝血酶部分。 DEAE纤维素（DE-52）柱层析 经DE-22柱层析分离之激肽释放酶部分稀释酶部分稀释到电导为0.15×104后（约6000ml)，于冷室中上DE-52柱（4×23cm)，0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液平衡），上柱流速100ml/h，约75%的杂蛋白不被吸附而流出。然后用0～0.05mol氯化钠（各1000ml，配于同一缓冲液）梯度洗脱出一个含有激肽释放酶活力的蛋白峰。 DEAE纤维素（DE-22）重层析 DE-52层析收集液经透析、冷冻干燥后共得200mg粗制品，称取70mg溶于0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液，在DE-22柱（2.3×19cm，同一缓冲液平衡）上重层析。梯度洗脱，第1级用0～0.05mol氯化钠（各500ml)，第2级用0.05～0.1mol氯化钠（各250ml)，均配于0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液，流速为50ml/h，每管收集13ml。 从猪胰制取弹性酶 丙酮粉制备 交鲜猪胰绞碎，加3倍量0℃以下的丙酮，于0℃左右搅拌脱水1h，离心，湿饼继加3倍量丙酮，同法操作，湿饼置真空干燥箱抽干，粉碎，低温密闭保存，即得。 提取 取丙酮粉加水（1：20）于20～50℃搅拌提取2h，提取物以少量滑石粉助滤，用锦纶布自然过滤或经板框压滤（20℃以下操作），得澄清提取液。 树脂吸附 滤液用蒸馏水稀释至2～3倍，加0.1mol/LpH6.4磷酸盐缓冲液平衡过的Amberlite CG-50树脂（原料：树脂=1：2），于20～25℃搅拌吸附2h，收集树脂，用蒸馏水漂洗树脂至洗液无色。 解吸 将树脂加入pH9.3的0.5mol/L氯化铵缓冲液中（树脂：缓冲液=1:1.5)，搅拌洗脱1h，分离树脂，洗脱液以2mol/L醋酸调至中性，过滤，得澄清解吸液。 丙酮沉淀 于-5℃下边搅拌边加入3倍量-5℃丙酮，加完后继续搅拌10min，于-5℃静置，沉淀粉h。 脱水干燥，收集沉淀，用丙酮、乙醚各洗2～3次，真空干燥，得弹性酶粉。 弹性酶纯化 DEAE-Sephadex A-50层析 层析柱（3×100cm)预先用pH9.5的0.01mol/L碳酸盐缓冲液平衡。取药用弹性酶原粉5g用250ml相同缓冲液溶解。滤液沿柱壁缓缓加入，以1ml/min流速进柱。待样品完全进柱后，用0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液洗脱，分部收集，分别测定蛋白质浓度（测定280nm吸收度）及酶活力。 CM-纤维素层析 CM-纤维素层析柱2×40cm，预先以0.02mol/L醋酸缓冲液平衡。取经DEAE-Sephadex A-50层析分离获得的峰A组分125ml，用2mol/L醋酸调pH5，溶液沿柱壁缓缓加入柱顶，以0.5ml/min流速进柱。待样品完全进柱后，用0.05mol/L pH5醋酸缓冲液和1mol/L氯化钠溶液进行梯度纯化。 地衣红弹性蛋白法 地衣红弹性蛋白的制备 取新鲜猎犬动脉管，用丙酮、乙醚脱水脱脂，用氢氧化钠溶液水解，水洗抽干得弹性蛋白。再用1%地衣红溶液在70%乙醇中磁力搅拌使弹性蛋白染色后，用70%乙醇洗至无色。再用水洗涤，最后以少量无水乙醇洗涤。抽滤，干燥即得。 浙江蝮蛇蛇毒精氨酸酯酶的分离纯化 蝮蛇粗毒中精氨酸酯酶的层析图谱 取200mg腹蛇粗毒，溶于含10-2molEDTA的0.005mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液中，使粗毒中含金属的蛋白酶失活。然后再对含10-4mol EDTA 的同一磷酸盐缓冲液透平衡，上DE-52层析柱（1.5×14cm)。用不同浓度的氯化钠作线性梯度洗脱。第1个蛋白峰含有磷酯酶A活性，此外有3个精氨酸酯酶活力峰。经生物活力鉴定，激肽释放活性、凝血活性分别位于第1及第2个酯酶活力峰，第3个酯酶峰具有纤维蛋白溶解活力。在第2和第3个酯酶活力峰之间具有神经毒素的活力。第2个酯酶峰即为类凝血酶部分，其精氨酸酯酶活力约占总酯酶活力的60%左右。 类凝血酶的分离纯化 Sephadex G-25柱层析：为了综合利用蛇毒中各种活性组分，先用Sephadex G-25分离活性小肽——舒缓激肽增强因子。取21g粗毒，共分7批，每批3g溶于10ml0.005mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（内含0.1mol EDTA）中，离心取上清液上柱（4.0×65cm)，用内含10-4mol EDTA 的同一磷酸盐缓冲液洗脱。经Sephadex G-25分离后，大致分为2部分，即先洗脱的大分子蛋白质及后洗脱的小分子多肽。后者用于提取激肽增强因子，将前者的收集液合并供下一步纯化。 DE-11纤维素柱层析：将上述合并液直接上事先已用0.005mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液平衡过的DE-11层析柱（4.0×95cm)，然后用不同氯化钠浓度的同一磷酸盐缓冲液分级洗脱。第1个蛋白峰收集后用于磷酯酶A的制备。具有精基酸酯酶活力的峰，经生物活力鉴定，第1、2酯酶峰为激肽释放酶，但混杂有类凝血酶活力。第3个酯酶峰为类凝血酶，突触前神经毒素位于其后，分别合并洗脱液，对蒸馏水透析后冷冻干燥备用。 DE-52纤维素柱层析：取上述类凝血酶组分冻干物100mg溶于10ml的0.005mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液中，并用同一缓冲液平衡DE-52纤维素柱（1.5×14cm)。上样后用不同浓度的氯化钠直线梯度洗脱。精氨酸酯酶活力测定显示有1个主峰和2个小峰，主峰即为类凝血酶组分。其后的杂蛋白峰呈黄色，很可能是含核黄素辅基的L-氨基酸氧化酶。合并酯酶活力的主峰部分，用饱和硫酸铵及反透析沉淀。收集沉淀并对0.005mol/L pH8.0的磷酸盐缓冲液透析平衡，再在DE-52纤维素柱上重层析一次，又可除去部分杂蛋白。 Sephadex G-75凝胶过滤：将上述纯化的类凝血酶20mg溶于1ml含0.2mol/L氯化钠的0.02mol/L碳酸氢钠液中，样品上于Sephadex G-75柱（1.3×150cm)，并以同一溶液洗脱，可得一对称的蛋白峰。它与精氨酸酯酶的活力峰相吻合。生物活力测定表明，它能使纤维蛋白凝固，此即提纯后的蝮蛇毒类凝血酶。 提纯后的类凝血酶在7.5%和10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳上都呈一条带。用过碘酸-Schiff试剂作糖蛋白染色也同样可得到一条粉红色区带，位置与蛋白区带致，说明蝮蛇类凝血酶为一糖蛋白。 竹叶青蛇毒分离凝血酶
竹叶青天蛇毒类血酶组分Ⅰ的分离纯 1g粗毒用CM-Sephadex C-25分离，柱2.1×105cm，缓冲液为0.005mol/L醋酸钠-醋酸（pH5.0)，从70管起加氯化钠（0-1mol/L)梯度洗脱，流速20ml/h，5ml/管，组分Ⅰ及Ⅱ均集中于1峰。此峰用DEAE-Sephadex A-50分离，柱1.6×100cm，缓冲液为0.01mol/L Tris-盐酸（pH7.1)，用氯化钠（0～0.5mol/L）梯度洗脱，流速20ml/h，5ml/管，组分Ⅰ集中2峰，组分Ⅱ集中4峰。2峰再用CM-Sephadex C-25分离，柱1.7×33cm，缓冲液为0.05mol/L醋酸钠-醋酸（pH5.0)洗脱，流速12ml/h，4ml/管，1 峰为纯化的组分Ⅰ。 竹叶青蛇毒类凝血酶组分Ⅱ的分离纯化 0.5g粗毒用DEAE-Sephadex A-50分离，组分Ⅱ集中于15峰，15峰再用DEAE-Sephadex CL-6B纯化，柱1.6×13cm，缓冲液为0.025mol/L Tris-盐酸（pH7.3)，用氯化钠（0～0.6mol/L)梯度洗脱，流速12ml/h，4ml/管，第1峰为纯化的组分Ⅱ。 蚯蚓中分离纯化蚯蚓纤溶酶 将人工养殖的蚯蚓放入水中浸泡1h，使其内脏中的污物尽量排出。取洗净后的蚯蚓在组织捣碎器中匀浆，再加入等体积0.1mol/L氯化钠溶液，于冰箱内提取6h，然后以6000rpm离心20min，弃去沉淀，上清液加固体硫酸铵至0.7饱和度，冰箱放置过夜，次日过滤，收集硫酸铵沉淀部分，透析去盐，以8000rpm离心30min，上清部分冷冻干燥，得蚯蚓纤溶酶粗品。将粗品经Sephadex G-75柱凝胶过滤，分为三个组分，纤溶活性集中于B峰。将B峰合并，透析，冷冻干燥。称取B峰40mg在DEAE-Sepharose CL-6B柱上层析分离，层析柱以0.02mol/L，pH7.8磷酸盐缓冲液平衡，样品上柱后用氯化钠溶液梯度洗脱，其中峰B-Ⅱ至B-Ⅷ具有纤溶活性。再经高速蛋白质液相色谱对B-Ⅱ和B-Ⅷ进一步纯化，得B-Ⅱ-1、B-Ⅷ-1、B-Ⅷ-2，分子量分别为3000、25000、30000，B-Ⅷ-2由248氨基酸组成，N-末端为亮氨酸。 蚯蚓中分离纤溶激活物 取洗净的蚯蚓500g加入1200ml生理盐水（含0.1%苯甲酸钠）在组织捣碎器中匀浆（2000rpm)3min，搅拌提取1h，37℃孵育48～96h。将孵育液用4层纱布过滤，合并滤液，3000rpm离心15min。取上清液预冷至-10℃，加入乙醇使含醇量为50%，弃去沉淀，上清液调含醇量为80%，收集沉淀，干燥物为纤溶激活物F1（收率4～5g/kg，活性为2049.5mm/mg，经凝胶层析每kg蚯蚓得4～5g的102IU/mgF1)。 将Sephadex G-75凝胶渗透层析柱用pH7～8的0.05mol/L磷酸盐液和0.5mol/L氯化钠的混合液平衡，取F1O.1g溶于4ml该混合液上柱，并用此混合液洗脱，分部收集。各组分分别经Sephadex G-25或Sephadex G-15脱盐，收集280nm蛋白峰部分冻干，活性部分为F2。将F250mg溶于2ml上述混合液中，上预先用此混合液平衡过的DEAE-Sephadex A柱，用同一混合液洗脱，分部收集，再经Sephadex G15脱盐，冻干。其活性部分为F3。F3分子量28000（凝胶层析），在278nm处有最大吸收。 由鸭血清制备假性胆碱酯酶 鸭酶的制备： 将鸭血清加入0.35饱和度硫酸铵，离心沉淀，所得清液酸化，即用2.5mol/L硫酸调节pH值在2.8～2.9为宜，则分离出大量杂蛋白。然后，将酸化清液加入硫酸铵至0.6饱和度，放置冰箱内过夜，则盐析液分为2层：上层为淡棕色絮状物，下层为棕色清液（有时沉淀在下层），虹吸出清液弃去。将絮状物抽滤得滤饼，以适量蒸馏水溶解之，加入饱和硫酸铵溶液使之成0.4饱和度，放置过夜，上层为淡棕色絮状物，下层为灰白色液体，虹吸出液体，于布氏漏斗滤纸上铺一层滑石粉，再加适量硅藻土过滤，则收集无色澄清滤夜，加入硫酸铵使成0.85饱和度，放置过夜，上层为无色清液，下层为微黄色絮状沉淀，抽滤成滤饼，以适量蒸馏水溶解之，倾入透析袋中对水透析，直至酶液中硫酸铵去尽。最后，稀释一定活性单位，用2m-1安瓿装入0.5ml酶液冷冻干燥成粉剂。经多次扩大生产制备，所制得的产品质量统计如下 ：比活为1550±586U/mg，收率为8.4±3.7%，提纯倍数为50.1±23.1倍。 鸭酶进一步纯化： 称取2g鸭酶冰冻干粉，溶于40ml0.1mol/L pH7.4磷酸钠缓冲液中，该缓冲液中含有0.04%JFC；0.01%oP10表面活性剂。尔后将酶液加至80×4.5cm柱床的Sephadex G-200中 ，于室温下（15℃）用同一缓冲液进行洗脱，流速为0.5ml/min ，洗脱液开始流出的150ml之后，先后收集到具有胆碱酯酶活性的2个峰组分，大峰组分体积约为100ml，小峰组分体积约为150ml。 测试方法： 蛋白浓度系按Folin方法测定。 酶活性采用Ellman方法测定，即Busch-DTNB比色法测定。活性单位（U）在本测定条件下，拟定为当1ml最适酶量，在37℃0.2mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中，1min内催化剂解4ml0.5mmol/L碘化硫代丁酰胆碱底物（含0.05%DTNB，即5,5-双-硫赶-双-硝基苯酸显色剂），所产生的产物吸收度（44-nm)变化为0.10.D值，即定为一个酶活性单位（U）。 抑制测定 将最适酶量（0.D值选在0.500～0.600范围）与一定浓度的抑制剂量，按1：1等体积反应，于37℃下，抑制一定时间（测定抑制百分离时，时间为5min，而测定抑制速率时则分别选定30s至5min不同时间间隔进行抑制反应）后，吸取1ml反应液加入4ml上述底物溶液中，保温5min，即刻加入1ml3%SDS溶液，停止反应，于10ml比色池、440nm波长处比色测定吸收度值。 底物的水解速率测定 鸭血清胆碱酯酶对各种底物的催化水解速率比较，系采用Radiometer自动滴定仪进行恒pH值测定，反应体系是：胆碱酯类底物浓度为0.004mol/L；非胆碱酯类底物浓度为0.0016mol/L，皆以0.04mol/L氯化镁（6H2O），0.1mol/L氯化钠溶液配制成底物溶液。氢氧化钠标准浓度为0.023mol/L。反应温度37℃。加入上述底物溶液25ml，用碱液调节pH值至8.0，记录底物10min内自发水解速率。然后加入1ml预保温酶液（598.8U/ml)自动记录耗碱量随时间变化的曲线图，从图上即可测出不同底物的酶促水解速率。 从蛋清中提取溶菌酶 工艺路线： [吸附] [洗涤] [洗脱] [盐析] [透析] [去碱性蛋白] 蛋清─────→吸附溶菌酶的树脂──洗涤后的树脂───→洗脱液───→盐析物───→透析液─→ [冻干] →────→溶菌酶───────[制剂] 清液─│ │──→肠溶片、口含片或粉剂 →────→沉淀──→溶菌酶丙酮粉 [沉淀] [干燥] 工艺过程： 吸附 新鲜冰冻蛋清（或蛋壳水）540kg，解冻后通过筛网，却除杂质，于5～10℃加入处理好的树脂80kg(pH6.5)，搅拌吸附6h，低温静置过夜。 洗涤、洗脱 倾出上层清液（供食用），树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去粘附的蛋白液，装入柱内，用0.15mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液150l左右洗涤树脂，然后用600l10%硫酸铵洗脱，流速控制在50l/h左右，收集洗脱液。 硫酸铵盐析 洗脱液按体积补加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，此时有白色沉淀产生，冷处放置过夜。 透析、去碱性蛋白 次日，虹吸上层清液，沉淀吸滤抽干，盐析物用1倍量蒸馏水溶解成稀糊状，装入透析袋。在5℃左右对蒸馏水透析24h左右，换水2～3次，离心除去沉淀，沉淀用少量蒸馏水洗一次再离心，弃去沉淀，洗涤液与离心液合并。 冷冻干燥 向透析清液慢慢加入1mol/L氢氧化钠液，同时不断搅拌，使pH值上升到8.0～9.0，如有白色沉淀，立即离心除去，然后用3mol/L盐酸调pH5.0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。收率：每kg蛋清2.5～3g，每kg蛋壳水约1～1.5g。供配制口含片、肠溶衣片及外用粉剂。 也可将离心液用3mol/L盐酸调pH3.5，在搅拌下缓慢加入5%（W/V）固体氯化钠，5℃左右静置48h，离心收集溶菌酶沉淀。加入10倍量冷至0℃左右的无水丙酮脱水，所得丙酮沉淀物于五氧化二磷真空干燥器中干燥。 从蛋壳膜制取溶菌酶 工艺流程： 抽提3次 →沉淀 7kg蛋壳──→抽提液21000ml──→│ →沉淀──→回收聚丙烯酸 →上清液18500ml→凝聚物│ →沉淀 →上清液│ 工艺过程： → 上清液→结晶 抽提 蛋壳膜（包括新鲜和冰冻的流清或粘壳蛋的蛋壳），用循环水冲洗后粗碎，加1.5倍量0.5%氯化钠溶液，用2mol/L盐酸调pH3.0，40℃搅拌提取45min，过滤。滤渣再加上提取2次，合并前两次滤液。第3次滤液作一批提取用。 选择性热变性及等电点沉淀 将提取液调整至pH3.0，于沸水浴中迅℃速升温至80℃，随即搅拌冷却，再用醋酸调整pH4.6，促使卵蛋白在等电点沉淀，离心或“吊滤”。 聚丙烯酸凝聚 加入清液体积一半量的5%聚丙烯酸（pH3.0)，搅匀后静置15min，倾去上层混浊液，得粘附于器底的溶菌酶-聚丙烯酸凝聚物。 凝聚物解离 凝聚物悬于水中，加碳酸钠溶液调整pH至9.5，使凝聚物溶解，再加入聚丙烯酸用量二十五分之一的50%氯化钙溶液使溶菌酶解离。用2mol/L盐酸调pH6.0，离心分离上清液。沉淀可用硫酸处理后除去硫酸钙沉淀，回收聚丙烯酸。 结晶 清液用氢氧化钠溶液调pH至9.5，离心除去氢氧化钙沉淀。上清液加入氯化钠至5%，静置结晶。粗结晶溶于pH4.6醋酸水中，分去不溶物，进行再结晶。每kg蛋壳膜可获得再结晶产品近1g。 溶菌酶的精制 可用甲壳质亲合层析和DEAE纤维素层析两种纯化方法精制。 全过程试验包括粗酶液→甲壳质亲合吸附层析→透析→DEAE-纤维素层析→冷冻干燥。 操作步骤： 粗酶液 弱酸型树脂吸附蛋清后的洗脱液，稀释一倍后，含溶菌酶约5mg/ml，硫酸铵0.27%。上柱量1,400ml。 甲壳质亲合吸附层析 甲壳质柱准备：220g干甲壳质（颗粒大小＜2.5mm)，pH8水浸泡平衡后装柱，柱直径8cm，高44cm。 吸附：1400ml粗酶液，流速约250ml/h，待酶液上完后，用pH8蒸馏水流洗（室温15℃）。 洗涤：pH2.5的0.6%醋酸溶液洗脱，流速约250ml/h。用10%三氯醋酸检试，从洗脱液混浊开始收集流出液，至混浊不明为止。共收集洗脱液1,540ml。 透析：洗脱液装肠衣袋，低温透析12h，换蒸馏水3次。 DEAE-纤维素层析 pH8.3 0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡过的DEAE-纤维素，装柱直径2.8cm，高20cm。透析后的酶液调pH8.5，通过柱后收集流出液。 冷冻干燥 上述流出液用盐酸调pH至5.5后冷冻干燥，得白色粉末状成品。 粗酶液通过纯化后得率在70%以上。由于蛋清通过724型弱酸性树脂层析后已达到一定纯度，含杂蛋白量少，所以进一步纯化，比活力提高的倍数不高。另外，甲壳质层析以后体积比较大，如进行更大规格的纯化时，可以再通过一些浓缩手段，也可以用硫酸铵盐析，体积可以大大缩小，但同时也多少会带来得率的减少。 羧甲基甲壳质亲合层析制备溶菌酶 甲壳质是溶菌酶的类似底物，能与溶菌酶形成酶—底物复合物，因此可将甲壳质羧甲基化后制成羧甲基壳质，作为亲合吸附剂来提取、精制溶菌酶。 羧甲基甲壳质制备 取10g甲壳质粉末，加入100ml40%氢氧化钠，搅匀后于30℃减压放置3h，所得悬浮液抽滤，滤饼与其重量3.5倍的碎冰（-10～20℃）混合，搅匀，然后将得到的透明碱性甲壳质用500ml14%氢氧化钠液稀释以降低粘性，并在不断搅拌下加入40ml含10g一氯醋酸的14%氢氧化钠溶液，再于30℃下搅拌1h，待反应完毕后用浓醋酸中和反应液。最后将得到的白絮状羧甲基甲壳质用0.2mol/L氢氧化钠和0.2mol/L盐酸充分交换洗涤，再用蒸馏水洗涤干净，80℃烘干，粉碎，过筛，即得。 羧甲基甲壳质亲合层析：
鸟类卵白经SP-Sephadex C-25柱吸附制取溶菌酶 取鸡或火鸡卵白加同量10mmol/L磷酸盐缓冲液，充分混匀，104×g离心分离15min。将上清液经SP-Sephadex C-25柱吸附，5mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0)洗净后，用0.5mol/L碳酸铵溶出，再经Bio-Rex70柱，用含0.2mol-L磷酸盐缓冲液（pH7.0)-0.3mol/L氯化钠缓冲液（pH7.3)精制。产物经电泳显单一区带。 从羊睾丸制取药用透明质酸酶 工艺路线： [绞碎、提取] [盐析、吊滤] [精制] [去热原] [过滤、干燥] 羊睾丸───→提取液───→粗制品───→精制液───→无热原精制液───→透明质酸酶精品 [制剂] 原料───→成品 [冻干] 工艺过程 提取 将冷冻的新鲜羊睾丸用刀切开，剥除内外皮层副睾丸，绞成糜浆。称取糜浆100kg，倒入预先配好的冷醋酸液（水90kg，冰醋酸600ml，1mol/L盐酸10l混合而成）中，在冷库（-5℃以下）内激烈搅拌3、4min，以后每隔5min搅拌一次，提取4h，然后进行扯浆，得提取液约125～140l。浆渣作2次提取，提取酸液量为第1次用量的三分之一。 硫酸铵分段盐析 在不断搅拌下，每l提取液加入固体硫酸铵（工业用）210g，完全溶解后静置1h左右，用双层涤纶布袋吊滤过夜，得清液约100l。在不断搅拌下，每l滤液再加入固体硫酸铵290g，完全溶解后静置1h，吊液过夜，次日拆袋得透明质酸酶粗品。 精制 将粗品溶于5l冰冷蒸馏水中，在不断搅拌下缓缓加入化学纯硫酸铵1250g，使完全溶解，在10℃左右放置过夜。次日除去液面脂肪，虹吸出中层清液，并经布氏漏斗减压过滤。最后，将上层脂肪和下层沉淀用布氏漏斗过滤，合并滤液，在不断搅拌下，再缓缓加入化学纯硫酸铵750g，使完全溶解，在10℃左右放置过夜。次日吸上去层清液，得潮固体。如清液混浊，可在冷库内再放置2～3天，使沉淀完全，收集沉淀，与上述潮固体合并。 透析 将潮固体溶于500ml冷蒸馏水中，装入透析袋，放在25lpH6.5中，10℃左右透析24h后过滤，得透析液（每ml约25万单位）。 除热原、冻干 透析液于冰浴中冷却，加入15%磷酸钠（12H2O）50ml，在不断搅拌下缓缓加入20%醋酸钙液30ml，并以0.5mol/L氢氧化钠液调pH至8.5，继续搅拌10min，用4号垂熔漏斗减压过滤（滤瓶放在冰浴中），滤液以0.5mol/L盐酸调pH7.0，冷冻干燥，得无热原透明质酸酶精品。收率：每kg睾丸可得2万U以上。 制剂 将透明质酸酶精品溶于无热原蒸馏水中，稀释至规定浓度，加入适量5%注射用水解明胶（每瓶0.5ml内含透明质酸酶150单位或1500单位，加5mg5%水解明胶），用1mol/L氢氧化钠液调pH5～7，然后用6号除菌漏斗过滤，分装，冷冻干燥，即得成品。 尖吻蝮蛇毒透明质酸酶的纯化 CM-Sephadex C-50柱层析分离 粗毒的分离用阳离子交换葡聚糖CM-Sephadex C-50分 3级洗脱，第1级用平衡缓冲液洗脱，第2第3级分别用直线盐浓度梯度洗脱。 精毒用150ml平衡缓冲液流洗后，约半数以上的蛋白质分3个洗脱峰流出。透明质酸酶出现在第2级洗脱过程，介于两个蛋白质峰之间的峰谷处，部分收集，比活力比粗毒提高了18倍，有出血活性。 从牛胰中提取糜蛋白酶 工艺路线： [硫酸提取] [分段盐析] [结晶] [激活] [结晶] 牛胰───→抽提液───→沉淀物───→糜蛋白酶原───→活化液───→糜蛋白酶结晶 [透析] [制剂] ───→透析液──→成品 [冻干] 工艺过程： 提取 牛宰杀后在1h内取出胰脏并去除脂肪和结缔组织，立即浸入预先冷冻的0.125mol/L硫酸中，迅速冷却，在0℃左右保存。将胰脏自酸中取出，用绞肉机（孔径2～3mm，反复绞3次使成胰浆，再用2倍量冰冷0.125mol/L硫酸（包括原先浸泡胰脏的酸液在内），在冷室中浸渍24h，每隔1～2h搅拌一次。将浸渍物粗滤。滤液呈乳白色。将上层清液虹吸出；沉淀加入适量硅藻土助滤，合并上清液与滤液，得提取液。 分段盐析 每升提取液继续加固体硫酸铵205g，使达0.7饱和度，放冷室过夜，次日吸去上清液弃去，下层沉淀抽滤至干。按滤饼重加3倍冰水溶解，加入滤饼重量一半的饱和硫酸铵溶液，并用5mol/L氢氧化钠液调节pH值5.0为止；静置于恒温箱中，在25℃保温48h，进行结晶，用布氏漏斗过滤至干，即为糜蛋白酶原粗制品。滤液供制备胰蛋白酶原。 取粗制品称重，加入7倍量冷蒸馏水，并滴加硫酸（2.5mol/L）至pH达2.0左右，使溶，溶液加滑石粉助滤，滤液应澄清，加入2倍量饱和硫酸铵溶液，并滴加5mol/L氢氧化钠溶液，使pH达5.0，在20～50℃保温静置4h以上，即有白色沉淀物析出，置显微镜下观察为棒状结晶，过滤，弃去滤液，沉淀再按同法重复结晶三次，得糜蛋白酶原结晶。 激活、盐析、结晶 称取糜蛋白酶原结晶，按其重量加入3倍量冰冷蒸馏水，并滴加少量2.5mol/L硫酸溶解；然后加入1倍量pH7.60.5mol/L磷酸缓冲液及与所加入2.5mol/L硫酸相当量的氢氧化钠，使pH值稳定在7.6，再加入少量胰蛋白酶，置5℃冰箱2h后布氏漏斗减压过滤，弃去滤液（可回收部分结晶）。取以上沉淀物称其重量加入四分之三倍量0.005mol/L硫酸使其溶解，所得溶液用酸洗滑石粉助滤至清。加入少量α-糜蛋白酶晶种，在20～25℃放置24h，即有大量结晶形成，用布氏漏斗抽滤至干。 透析、灭菌、冻干 将上述结晶加入2.5倍量重蒸馏水，并滴加0.005mol/L硫酸使溶解，装入透析袋悬于水浴中，使内外溶液在同一水平线上，于5℃冰箱中或冷室中用自来水连续透析48～72h（直至透析液用氯化钡试剂检查无显著沉淀即可）。将袋内液用滑石粉助滤至清，然后进行除菌过滤，冷冻干燥，即得成品。 从羊胰提取胰蛋白酶 工艺路线： [重结晶] [提取] →胰蛋白酶结晶───→注射用羊胰蛋白酶 羊胰──→抽提液──→沉淀物──────→│ [透析] →母液────→外用羊胰蛋白酶 工艺过程： 提取 新鲜羊胰或鲜冻羊胰，剥去脂肪和结缔组织后，用绞肉机绞碎，每10kg胰浆加0.1mol/L硫酸溶液（116ml工业硫酸，加水到20kg)20kg，搅拌1～2h后，放置过夜。次日，在不断搅拌下逐渐加入3.25kg工业硫酸铵，使硫酸铵浓度达0.3饱和度，约1h加完，待硫酸铵完全溶解后，再放置3～5h，过滤得提取液，滤液弃去。 分段盐析 每10l提取液在不断搅拌下加入工业硫酸铵2.73kg，1～2h加完，使达0.7饱和度，放置过夜。次日吸去上层清液（上层清液可供提供核糖核酸酶），过滤下层沉淀，得430g滤饼。滤饼以4倍体积蒸馏水溶解，每l溶解液加176g化学纯硫酸铵使达0.3饱和度，放置3～5h后用滤纸过滤，弃去滤饼。每l滤液补加273g化学纯硫酸铵，使达0.7饱和度，放置过夜，次日减压抽干，每10kg羊胰可得300g滤饼。 透析、结晶 300g滤饼加入0.4mol/LpH9.0硼酸缓冲液（49.9g硼酸溶于蒸馏水，加80ml5mol/L氢氧化钠或16g固体氢氧化钠，加蒸馏水稀释到1l，pH值达9～10，当与饱和硫酸镁混合时，pH值会降低，因此pH不必调到9.0，加蒸馏水稀释1倍，即为0.4mol/L硼酸缓冲液）200ml溶解之，过滤除去了不溶物，再加200ml“结晶透析液”透析，每24h一次“结晶透析液”，3～4天后透析袋内开始出现结晶，约一周结晶完全。 重结晶、干燥 取出透析袋，袋内结晶用布氏漏斗抽滤，约得22g胰蛋白酶结晶，按上述结晶条件重结晶一次约得18g。过滤，结晶溶于0.01mol/L盐酸（8ml盐酸加蒸馏水10l)100ml，溶解后，在0.01mol/L盐酸中透析去盐，冷冻干燥，得结晶羊胰蛋白酶注射剂原料。收率：0.6g/kg(羊胰)：活力：150U/mg以上。结晶母液对0.01mol/L盐酸透析后过滤，用2mol/L氢氧化铵调至pH6.5左右，冷冻干燥即得外用羊胰蛋白酶原料。收率：5g/kg(羊胰）。 从猪胰中直接提取分离糜蛋白酶和胰蛋白酶 试用CM纤维素从猪胰中直接提取分离糜蛋白酶和胰蛋白酶，收率和活力都较满意。收率均在0.05%以上，不低于牛胰中提取的糜、胰蛋白酶收率。猪糜蛋白酶水解NTH（烟酰-L-酪氨酰肼）的活力高于牛糜蛋白酶2～3倍，猪胰蛋白酶水解BANA（N-苯甲酰-L-精氨酸-β-萘胺）的活力与牛胰蛋白酶相近。 工艺路线： 亲合层析法提取胰蛋白酶 卵粘蛋白的制备 粗品制备：将500g新鲜鸡蛋得350ml蛋清，置25～30℃水浴，不断搅拌下缓慢加入350ml三氯醋酸-丙酮溶液（0.5mol/L三氯醋酸与丙酮1：2V/V混合）出现大量白色絮状沉淀，继续搅拌30min，置4℃冰箱过夜。次日，抽滤得黄绿色清液，边搅拌边加预冷丙酮至滤液中出现沉淀，在冰箱放置2h，抽滤得5g滤饼。 纯化：将滤饼溶解调pH4.5，对水透析，然后用0.02mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液透析平衡，透析液上DEAE-纤维素柱，经洗脱，收集纯化卵粘蛋白。 固定化卵粘蛋白的制备 4%琼脂糖制备：将4g琼脂糖悬于100ml水中，加热溶解，冷却成凝胶，过40～50目筛，得颗粒状琼脂糖凝胶。 ABSE-琼脂糖制备 取适量SESA悬于4倍重量蒸馏水中， 搅拌下缓慢用1.5mol/L碳酸钠液调pH6.0，待溶解后离心，除去残渣，得琥珀色SESA清液。 重氮化ABSE-琼脂糖制备 将ABSE-琼脂糖加入20ml蒸馏水，置水浴中，搅拌下分别加入20ml预冷5%亚硝酸钠和mol/L盐酸，冰浴间歇搅拌20min，抽滤，用预冷0.05mol/L氢氧化钠液洗3次，冷蒸馏水洗，三次抽干即为重氮化ABSE-琼脂糖。 卵粘蛋白的偶联 将重氮化ABSE-琼脂糖投入纯化卵粘蛋白的溶液中，在冰浴（＜5℃）间歇搅拌，偶联反应4h，偶联完毕，抽滤用1mol/L氯化钠溶液洗2次，最后用蒸馏水洗涤，装柱，再用0.1mol/L甲酸和0.2mol/L Tris-盐酸溶液洗涤，最后用0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液平衡，即为平衡后的固定化卵粘蛋白。 亲合层析提取胰蛋白酶 上样液：称取胰原粗品500mg溶于0.1mol/L pH7.5Tris-盐酸缓冲液中，充分溶解后，待上柱。 装柱：将固定化卵粘蛋白装柱，层析柱为2×18cm，用0.1mol/LpH7.5Tris-盐酸缓冲液平衡。 吸附：将上样液流速控制在1.5ml/min上柱吸附。 淋洗：上样完毕，用上述平衡液淋洗，直至A280在0.02为止。 解吸：用0.1mol/L甲酸钠-0.5mol/L氯化钠pH2.5溶液进行洗脱，流速控制在1ml/min收集洗脱峰。 糜胰蛋白酶提取分离制备 工艺路线： →重结晶滤饼 猪胰───→提取液───→滤饼───→清液───→透析液───→滤饼───→│ [配液] →母液 ───→结晶糜胰蛋白酶──→注射用糜胰蛋白酶 [透析 、沉淀] ──→滤饼──→外用糜胰蛋白酶
工艺过程： 提取 取新鲜或冷冻猪胰，绞碎，加2倍体积的0.125mol/L硫酸溶液，搅拌提取1h，溶液pH约为3.0，于5℃放置过夜，次日用双层纱布过滤，滤液用等体积冷的0.125mol/L硫酸再提取一次，合并滤液。 分段盐析 在不断搅拌下，逐渐加入工业用硫酸铵至0.25饱和度，并加入少量活性白土助滤，低温放置一天后过滤。滤液再加硫酸铵至0.65饱和度，低温放置过夜，次日过滤，得粗制滤饼。将此滤饼溶于5倍体积冷蒸馏水中，用化学纯硫酸铵按上述步骤重复两次，取0.25～0.65饱和度沉淀部分，得粗制滤饼。 透析、盐析 将上述粗制滤饼溶于3倍冷蒸馏水中，在低温下对0.01mol/LpH5.5的醋酸缓冲液透析，透析液过滤，清液加化学纯硫酸铵至0.65饱和度，沉淀抽气过滤，得透析滤饼。 盐析、除杂蛋白 滤饼溶于3倍体冷蒸馏水中，调pH3.0～3.5，加化学纯硫酸铵至0.25饱和度，室温放置3～5h后，用0.5%活性碳助滤得澄清滤液。然后在不断搅拌下缓慢加入25℃左右的95%的乙醇，使乙醇浓度达10%，室温放置3h后过滤，得澄清溶液。 透析、沉淀 将重结晶滤饼溶于适量衡盐酸，对pH3～3.5的冰水透析，透析液滤清后，在低温下缓慢加入95%乙醇（化学纯）使醇浓度达70%，沉淀物过滤或离心，丙酮脱水3次，真空干燥，得注射用结晶糜胰蛋白酶原料。收率：4～7g/kg(猪胰）。 结晶和重结晶母液加硫酸铵至0.7饱和度，过滤，滤饼同上操作，得外用糜胰蛋白酶原料。 从牛胰提取胰蛋白酶的结晶母液中制取抑肽酶 抑肽酶可从牛胰、肺等组织中分离提以。现将从牛胰提取胰蛋白酶的结晶母液中制取抑肽酶的工艺介绍如下： 工艺路线： [沉淀过滤] [盐析] [溶解、去杂蛋白] [再盐析] [溶解] [分段盐析] 胰蛋白酶结晶母液───→澄清液───→盐析物───→滤液───→盐析物───→滤液───→ [溶解盐析] [透析] [5mol/L氢氧化钠] [中和] [去热原、干燥] 盐析物───→盐析物───→透析液───→碱性溶液───→抑肽酶制剂溶液───→抑肽酶 工艺过程： 沉淀、过滤 取胰蛋白酶结晶母液置烧杯中，在不断搅拌下，滴加3mol/L硫酸直至溶液pH降至3.0左右，放置冰箱过夜，使沉淀析出。加入适量硅藻土搅拌均匀，反复减压过滤至清。 盐析 滤液置水浴上加温，保持25℃，不断搅拌下加入化学纯固体硫酸镁，保温搅拌1h，直至稍过饱和，置25℃恒温箱中过夜，使沉淀析出，次日，用布氏漏斗减压过滤，收集盐析物。 溶解、去杂蛋白 盐析物溶于5倍量蒸馏水中，加适量硅藻土，减压过滤，过滤得液，加入等量5%三氯醋酸，即有白色沉淀生成，在不断搅拌下，加热至80℃，保温5min，使非活性蛋白完全凝固，立即用自来水冷却至25℃,减压过滤，得澄清滤液。 再盐析 滤液用5mol/L氢氧化钠调pH3.0左右，然后于水浴加热，保持25℃，不断搅拌下加入硫酸镁使饱和之，置25℃恒温箱过夜，使沉淀析出。次日减压过滤，收集盐析物。 溶解、过滤 将盐析物溶于3倍量蒸馏水中搅拌溶解，滤去不溶物，滤液用硼酸缓冲液（硼酸49.6g及氢氧化钠16g加蒸馏水溶解后配成1000ml），调pH至8.0，倾入30倍量沸腾蒸馏水，并继续加热1min，立即流水冷至25℃。 硫酸铵分段盐析 溶液加入化学纯固体硫酸铵至0.4饱和度（242g/L)，于冰箱中放置1～2h后，取出混浊液，加入适量硅藻土，用布氏漏斗减压过滤，得澄清滤液，再补加硫酸铵使达7.0饱和度（205g/L)于冰箱中放置过夜。次日用布氏漏斗减压过滤，得盐析物。 溶解、盐析 将盐析物溶于4倍量pH5.5、0.7mol/L醋酸钠缓冲溶液（醋酸钠8.2g或CH3COONa·3H2O13.6g配成1,000ml，用0.2mol/L醋酸调pH5.5）中，滤去上溶物，滤液用硼酸盐缓冲液调pH5.5，然后加入硫析物重5倍量的pH5.5，0.1mol/L醋酸钠缓冲液，使溶液总体积约为沉淀重的10倍，然后在5℃保温下，加入硫酸镁使之饱和，置25℃恒温箱中过夜。次日减压过滤，收集盐析物。 透析 将盐析物溶于10倍量蒸馏水中，装入透析袋，对流动水进行透析，直至无硫酸根为止。过滤除去沉淀。 去热原、干燥 透析液用5mol/L氢氧化钠调pH至11.0左右，于冰箱中（0～5℃）放置48h，然后滴加1mol/L盐酸调pH5.5左右，按无热原操作法用4号垂熔漏斗过滤，滤液冷冻干燥，即得注射用抑肽酶原料。 每kg胰脏约含1mg抑肽酶。生产1kg胰蛋白酶所得结晶母液仅可制得抑肽酶3g左右，产量低、成本高、价格昂贵，在使用上胺到了一定限制。也可以从牛肺中提取抑肽酶。 从牛肺中提取抑肽酶 取牛肺匀浆用0.1mol/L，pH7.8三乙醇胺缓冲液（含有0.3mol/L氯化钠和0.01mol/L氯化钙）提取，滤液用2.5%三氯醋酸除去杂蛋白，调pH至7.8，通过用上述缓冲液平衡过的胰蛋白酶—树脂柱，用上述缓冲液洗涤去杂蛋白，再用0.25mol/L、pH1.7～2.0的氯化钾-氯化钠缓冲液洗脱，洗脱液调pH5～6，于30℃浓缩，用0.01mol/L、pH7.0碳酸铵缓冲液平衡过的Sephadex G-25柱脱盐，流出液冷冻干燥。主品纯度为70～80%。 从牛血中提纯铜锌超氧歧化酶 工艺流程： [清洗] [溶血] [去血红蛋白] [分层] [丙酮沉淀] [动态透析] 牛血───→血球───→溶血液───→淡黄色清液───→黄色清液───→淡蓝色沉淀───→ [上柱] [浓缩] [冷冻干燥] 透析液───→收集液───→浓缩液───→产品 操作方法： 取新鲜牛血1l，2500rpm离心20min，除去黄色血浆液。血球用3倍体积的生理盐水清洗3次。干净的红细胞加入等体积的去离子水，搅拌溶血30min。 溶血液置冰盐溶液中，搅拌冷到0℃左右，缓慢加入0.25体积的冷95%乙醇，然后加入0.15体积的冷氯仿，搅拌15min，离心去血红蛋白沉淀，测定淡黄色清液中SOD活力和蛋白浓度。 淡黄色清液按体积加入磷酸氢二钾，搅拌，溶液置分液漏斗静置分层15min，弃去下清液。接着将上层黄色混浊液离心，弃去沉淀得黄色清液。 将黄色上清液置冰盐浴中冷至0℃以下，在搅拌情况下加入冷丙酮即产生大量沉淀，离心得微带蓝绿色的白色沉淀，然后加入8～10ml的去离子水，置透析袋中，用pH7.6的2.5mmol磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行动态透析5～6h。透析液离心，弃沉淀物，得淡黄绿色的上清液。 将上述黄绿色清液加到预先用2.5mmol/LpH7.6磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液平衡过的纤维素柱上，上样后的纤维素柱在前端可见一条蓝绿色的色带，然后用pH7.6的2.5～200mmol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液进行弹梯度洗脱。 将洗脱液浓缩、冷冻干燥得产品。 在操作过程中酶活力测定用邻苯三酚自氧化法，蛋白浓度测定用牛血清蛋白标准品，标准曲线用凯氏定氮法校正，测定波长280nm。 猪血超氧物歧化酶的提取纯化 工艺流程： [离心] [除去浮洗液] [去离子水] [乙醇、氯仿] [丙酮沉淀] [去离子水] [55～65℃] 新鲜猪血──→红细胞──→干净红细胞──→溶血──→上清液──→沉淀──→上清液──→清液 [去离子水] [磷酸盐缓冲液] [超滤] ──→沉淀──→清液──→透析──→收集液──→浓缩液──→冷冻干燥──→SOD成品 鲜肝中制取SOD 工艺流程： 0.9%NaCl洗 pH7.5缓冲液4℃ 离心 10～20min 丙酮 牛肝──→干净牛肝─────→匀浆──→上清液──→上清液──→沉淀─────→上清液 离心 离心、溶于缓冲液 透析 DE.32 洗脱 ─────→离心得沉淀──→清液──→透析液──→上柱──→洗脱液──→浓缩──→冷冻干燥 ───→SOD成品 从猪心提取细胞色素C 工艺流程： 粗制 提取：将新鲜或冷冻猪心洗去心血，绞碎。加入1.5倍量水，搅拌均匀，用1mol/L硫酸调整pH至4.0左右，于常温搅拌提取12h，压榨，滤液用2mol/L氨水调pH至6.0，充分静置沉淀。虹吸上清液，下层心渣离心甩干。合并清液，以2mol/L氨水调pH至7.5。 吸附：提取液用边疆式管状高速离心机（油水分离器）离心，清液缓缓通过人造沸石吸附柱（每L提取液约需80目沸石10g)。 洗涤：将吸附细丙的人造沸石倾出，用水搅拌洗涤3次，每次20min，继续用0.2%氯化钠溶液洗涤4次，再用水洗涤3次后，将人造沸石装柱。 洗脱：将25%硫酸铵溶液（比重1.15)缓缓加入吸附柱，控制流速使洗脱体积尽量少些。流出液变红时开始收集，至红色液尽即洗脱完毕。 盐析：洗脱液被加固体硫酸铵，搅拌溶解，使比重达1.24，10℃以下静置1h，过滤，滤液应澄明。 三氯醋酸沉淀，在搅拌下，分离出细丙沉淀。 透析：细丙沉淀用少量蒸馏水溶解，装入透析袋，对水透析至无硫酸根。 透析液过滤：得粗品溶液，加适量氯仿作防腐剂，置冰箱保存。 精制 吸附：将预处理Amberlite IRC-50铵型树脂按需要量装入吸附柱（吸附1g细丙约需干树脂7g），将粗品去氯仿，缓缓恒速流入吸附柱，树脂呈酱红色，吸附完毕后再用少量蒸馏水洗。 洗涤：吸附完毕将树脂上部含较多蛋白部分的浅色层取出单独处理。其余树脂倾出，用水洗涤3次，将水倾出，手戴乳胶手套反复搓树脂，以除去吸附杂质，搓后用蒸馏水洗涤，干搓、水洗村脂3～4次，直至水澄明。以后再用蒸馏水搅拌洗涤15～20次（每次15min)。 洗脱：洗好的树脂装柱，用无热原蒸馏水冲洗15min，除去可能污染的热源。用新鲜配制的0.4mol/L氯化钠-60mmol/L磷酸氢二钠混合液进行洗脱，流出液变红时开始分段收集，颜色较浅的为前段；深红色的为中段；快结束时颜色变浅的为后段。 前段和后段含杂蛋白较多，透析后重新吸附精制，浅色层树脂经洗脱后也作为回收处理。 透析：中段洗脱液装袋对蒸馏水透析，每h换水1次。经常轻轻摇动透析袋，透析至无氯离子。透析液滤清，加适量氯仿，置2～5℃处保存。 精制过程应使用无热原蒸馏水，所用氯仿要用蒸馏水洗去其中的醇类。 猪胰磷脂酶A2的活性测定 卵黄乳剂（将1个卵黄用蒸馏水搅拌均匀，使成为100ml，加0.22mol/L氯化钙液6ml）。33mmol/L去氧胆酸钠（DOC）液。0.1mol/L氢氧化钠液。 方法 取卵黄乳剂10ml加DOC液2.5ml，蒸馏水17.5ml，保持40℃，用0.1mol/L氢氧化钠液调pH为8。加适量酶液，使反应液保持pH为8所的0.1mol/L氢氧化钠液量用自动记录仪记录。 从胃粘膜联产胃膜素和胃蛋白酶 从胃粘膜分出胃膜素的母液中，边搅拌边继续加入冷丙酮。至比重约为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出。静置过夜后，沉淀于60～70℃真空干燥，即得。 丙酮脱水法 工艺过程： 绞碎 取猪胃粘膜通过筛板眼为3mm的绞肉机绞碎得胃粘膜糊。 消化 将胃粘膜糊置耐酸夹层锅中，在不断搅拌下用盐酸调pH2.8左右，水浴加热恒温在40℃～50℃搅拌消化4h，消化中每隔半h测温度，待胃粘膜消化呈半透明的浆液即可。 去杂质 将过滤好的胃浆置于缸待液温降到25℃以下时，搅拌加入少量氯仿，于室温静置24h以上。 丙酮脱水 将静置后的胃浆，放掉底层的氯仿及杂质（氯仿可回收），加入2倍量予冷0～5℃丙酮脱水4h，于低温操作室中操作。滤掉丙酮，沉淀物加入待量丙酮浸泡4h以上。 干燥 滤去丙酮，将沉淀物压干，放入真空罐内在40℃以下真空干燥8h，即得胃蛋白酶干品。 胃蛋白酶的精制 粗胃蛋白酶混合物的粗制 胃蛋白酶商品一般来源于猪，可经硫酸铵、硫酸镁、乙醇等分组沉淀得到沉淀，但不均一。结晶胃蛋白酶可用羟基磷灰石柱精制，但欲获得各种胃蛋白酶分子种并不容易。近年来有胃液中经DEAE-纤维素层析直接精制各种胃蛋白酶分子种的报告。 从猪胰制取胰酶 根据胰脏中所含的蛋白水解酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶）都能被胰蛋白酶自身激活的原理，采用稀醇提取激活，继以浓醇低温沉淀，经脱脂、低温干燥后即得胰酶。 工艺过程： 提取、激活 冻胰绞碎，在5～10℃放置4h左右，放入预先配制预冷至10℃以下的1.2～1.5倍量（W/V）的25～30%乙醇中，于0～10℃搅拌提取12h，吊滤得胰乳。胰渣以25～30%乙醇浸泡过夜，吊滤后滤液供下批投料提取用。胰乳于0～5℃放置激活24h。 沉淀 将已激活的胰乳在搅拌下加到预冷至5～10℃以下的乙醇中，并使乙醇浓度达60～70%，于0～5℃静置沉淀18～24h（如能在-5℃以下静置更好）。 粗制 次日吸去上层醇液，下层沉淀即为胰酶。将沉淀灌袋吊滤，直至滤去大部分乙醇，最后压干即为粗胰酶。压干后的粗酶做成12～14目颗粒。 脱脂 将粗制胰酶颗粒乙醚循环脱脂，至流出的乙醚用滤纸法试验无脂肪为止。在40℃以下热风吹干，球磨成60～80目细粉，即得胰酶原粉。抽样化验，用乳糖、葡萄糖或蔗糖稀释成1:25倍，即得药用胰酶成品。 注：胰蛋白酶原自身催化在pH6～8时反应速度最快。在无钙离子存在情况下制备胰酶时，一般可加入适量盐酸，在pH5～6时进行提取，收率较高。也有报告，认为pH应低于4，可获得更高收率。 胰蛋白酶原活化的同时存在分枝反应，在pH＜4时加入0.02mol/L钙离子，可以加速酶原的活化而抑制分枝反应的发生。因此，加入氯化钙有助于激活反应，而获得较高的收率。但过滤较困难。也可以用肠激酶活化。 本工艺制得的胰酶，其胰蛋白酶及胰淀粉酶含量较高，而脂肪酶活力很低。这是由于用乙醇提取沉淀，会使胰脂肪酶失活。为保持胰酶含有胰脏中按天然比例存在的酶特性，可将胰脏自溶后用丙酮沉淀或用水提取后再用丙酮沉淀胰酶。 以酸醇法提取过胰岛素的胰渣为原料，水提取后，用0.75饱和度硫酸铵盐析，经透析，65%乙醇沉淀干燥，也可获得质量良好的胰酶，也有报道，用40%丙酮从胰脏提取胰岛素，剩余残渣可提取胰酶。 胰酶的激活生产法 工艺过程： 绞碎 取猪胰脏通过板眼为3mm的绞肉机，反复绞两遍，得胰糊。 激活 胰糊中缓慢地加入0.01mol/L氢氧化钠液，同时快搅拌以免局部过浓，达pH7～8时，升温至38℃左右，加入肠激活酶或上批次的胰酶渣，也可用活化好的胰酶，用量为原料量的0.04%，搅拌3～4h，胰糊变稀，结缔组织呈离析状态时，用双层纱布过滤，得胰乳。滤渣在40℃下鼓干燥或冷冻保存备下次生产做激活剂用。 沉淀 胰乳中加入预冷的乙醇，使浓度达70%，于5℃处静置至上层澄清。 吊滤、压榨、脱脂、 滤吸除上层澄清乙醇后，将沉淀移入吊袋，吊滤沥除乙醇，再行压榨，然后将干块放入脱脂器中，循环脱酯后取出在40℃处鼓风干燥。 粉碎 干燥后的胰酶块放入球磨机中粉碎，然后过80目筛，即得胰酶粉。
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