胆汁提取胆红素

一、生产工艺

1、配制石灰水：取优质石灰块，先加入少量自来水使生石灰溶解成粉末状，然后按1：25的比例再加入大量的水搅拌，制成乳白色的饱和石灰水溶液，充分搅拌，比重为1.02，静置后取饱和石灰水上清液使用。

2、胆钙盐的制备：称取胆汁，按1：3.5倍量加入饱和石灰水，充分搅拌5-10分钟，逐步加温至50-60℃去泡沫，再升温至全部沸腾，2分钟立即降压减温。待冷却后，用勺将大部分浮于液面的胆钙盐撇出，用纱布滤干。将锅中母液移入缸内供制备胆酸用，沉于缸底的小部分胆钙盐取出滤干（混合胆钙盐制备胆红素收率为8-10%）。

3、钙盐酸化：称取胆钙盐8-10公斤，加入80%的自来水将钙盐捣成液浆状，经30-40目过滤，在滤液中加入0.03%的偏重亚硫酸钠（抗氧剂）。在不断搅拌下加入6N的工业盐酸调节pH值至1.5，酸化4小时，或静置过夜，然后过滤得沉淀物。

4、酒精洗沉淀：取经酸化后的沉淀，加入8-10倍的酒精（90%），将沉淀捣碎混于酒精中，加入抗氧剂30克，静置过夜。次日虹吸上层酒精液。重复几次，用布氏滤斗滤干，即得含量30%以上的胆红素。

5、水洗：将沉淀物（抽干物）倒入2-3倍自来水中，加入0.03%抗氧剂，在50℃下水溶加温洗涤，用虹吸法吸去下层清液。

6、氯仿抽提：水洗后的沉淀物，加入4-5倍氯仿，充分搅拌并加入0.03%抗氧剂，置40℃水浴中4小时左右，进行分液处理。将下面含胆红素的抽提液分出并入原抽提液中用绸布过滤，收集滤液。

7、回收浓缩：将氯仿抽液装入球瓶中加入0.03%抗氧剂，接上冷凝管，加热蒸发回收氯仿。待回收瓶中胆红素浓缩倒入小搪瓷桶内，加入4-5倍80%以上的酒精，在水浴中蒸发30分钟，得胆红素浓缩液。

8、精制：将浓缩液倒入布氏漏斗中进行真空抽滤，干后加入95%酒精进行洗涤，再用无水乙醇洗涤抽滤2-3次。

9、干燥和送检：精制后湿胆红素盛入玻璃蒸发器中在50℃烘箱中脱水干燥得精品。精品纯度可达80%以上，色泽应为橙色。

二、胆红素含量测定

    胆红素和重氮化试剂反应，产生偶氮染料，它在强酸中呈蓝紫色，在pH值2.0-5.5之间呈红色，在pH值5.5以上则呈绿色。

1、标准溶液及试液配制：精密称取胆红素（北京药品生物制品检定所供给）0.0100克，供试品胆红素0.1-0.015克，分别以氯仿溶入100毫升棕色容量瓶中，加氯仿至刻度。各取10毫升加入50毫升棕色容量瓶中，以95%乙醇稀释至刻度。标准溶液每毫升相当于0.0002克胆红素。

2、胆红素标准曲线的绘制：精密吸取胆红素标准溶液0、1、2、3、4、5毫升到带色试管中，分别加入95%乙醇9、8、7、6、5、4毫升，使全量均为9毫升，再加入重氮化试剂1毫升，混合均匀，在20℃暗处静放1小时，在波长520微米处测定光密度，并以光密度为纵坐标，各管所含的胆红素浓度为横坐标，作出标准曲线。

3、胆红素样品测定：取供试液3毫升，加入95%乙醇6毫升，重氮试剂1毫升，混匀，在暗处20℃静置1小时，在波长520微米处测定光密度。由测得的光密度，从标准曲线查得胆红素的毫克数。

    样品胆红素%=标准曲线上查得的胆素(mg)×100×5÷样品(mg)÷3×100%